近年來土壤鹽堿化程度的不斷增加對植物生長、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及糧食供應等方面造成嚴重的影響。土壤中鹽與堿往往是相伴而生的,鹽脅迫一般會給植物造成滲透脅迫與離子損傷,而堿脅迫除了導致上述脅迫外,還會嚴重影響土壤的pH,阻礙植物對離子的正常吸收并擾亂細胞內(nèi)離子平衡,使細胞膜、植物根系與光合系統(tǒng)等受損,對植物的正常生長造成極大傷害。所以人們需要對鹽脅迫響應機制與堿脅迫響應機制進行深入研究,從而解決鹽、堿脅迫對植物造成的損傷。實驗室前期利用普通小麥濟南177(JN177)和長穗偃麥草通過不對稱體細胞雜交的技術,獲得了一系列小麥漸滲系,并從中選育了耐鹽的小麥漸滲系新品種—山融3號(SR3)與耐鹽堿的小麥漸滲系新品系—山融4號(SR4)。田間種植與實驗鑒定表明SR3與SR4具有很強的耐鹽堿能力,其中SR3耐鹽性更強,而SR4耐堿性突出。利用第二代高通量測序技術對SR3鹽處理與SR4堿處理后的轉錄組進行分析,挑選出一個在SR3根中受鹽脅迫誘導表達變化較大的WRKY家族轉錄因子TaWRKY46基因,一個在SR4根中受堿脅迫誘導上調(diào)表達的硝酸鹽轉運蛋白TaNRT1.2基因,進一步研究它們在鹽堿脅迫中的功能及作用機制。1.小麥鹽脅迫應答基因TaWRKY46的功能探究我們從SR3中克隆到一個約669 bp的TaWRKY46開放閱讀框。對其保守結構域分析后發(fā)現(xiàn)它是一個WRKY類轉錄因子,在多種非生物脅迫處理下呈現(xiàn)了不同的表達模式。TaWRK46主要定位于細胞核,在酵母系統(tǒng)中驗證了其具有體外轉錄激活活性。利用農(nóng)桿菌介導的方法將TaWRKY46轉化野生型擬南芥(Col-0),獲得了兩個TaWRKY46異源過量表達的純合株系(OE)。在正常生長條件下,TaWRKY46 OE系的生長與野生型植株無明顯差異,但是在鹽脅迫條件下,TaWRKY46OE系的葉片面積明顯小于野生型擬南芥,表現(xiàn)出對鹽脅迫的敏感性;氧化脅迫條件下,TaWRKY46OE系的葉片面積顯著大于對照,表現(xiàn)了對氧化脅迫的顯著抗性。DAB和NBT染色結果顯示TaWRKY46 OE系積累的ROS含量明顯低于野生型,ROS清除酶活性也有顯著提升,檢測過表達系與野生型的ROS信號通路中的marker gene發(fā)現(xiàn)ROS清除相關的基因CAT2、FeSOD1 FeSOD3、CuZnSOD3表達上調(diào),ROS合成相關的基因rbohC、rbohD、rbohE的表達下調(diào),因此我們推測ROS信號通路在TaWRKY46介導的鹽脅迫、氧化脅迫響應機制中發(fā)揮重要作用。此外,在施加外源ABA的條件下,OE系較野生型的生長總是被抑制的,表現(xiàn)出對ABA的敏感性。熒光實時定量PCR分析結果顯示,TaWRKY46OE系ABA信號通路中的marker gene ABA1,ABA2,ABI5的表達量明顯高于野生型,我們推測,ABA信號通路可能在TaWRKY46介導的鹽脅迫響應機制中發(fā)揮重要作用。2.小麥堿脅迫應答基因TaNRT1.2功能探究我們從SR4中克隆到一個約471 bp的開放閱讀框。它是一個硝酸鹽轉運蛋白,非生物脅迫分析顯示TaNRT1.2參與到了小麥對多種脅迫環(huán)境的響應。TaNRT1.2定位于細胞膜。將TaNRT1.2轉化野生型擬南芥(Col-0),獲得了兩個擬南芥過表達的純合株系(OE)。在正常生長條件下,TaNRT1.2擬南芥OE系的生長發(fā)育相較于野生型擬南芥無明顯差異,在堿脅迫與氧化脅迫條件下,TaNRT1.2過表達系的葉片面積顯著小于對照,主根根長明顯短于對照,展現(xiàn)了對堿脅迫與氧化脅迫的顯著敏感性。DAB和NBT染色結果顯示TaNRT1.2 OE系的ROS含量明顯高于野生型,且實時熒光定量PCR結果顯示,ROS合成相關的基因rbohC,rbohD,rbohE,brohF和rbohG表達發(fā)生明顯上調(diào),ROS清除相關的Cu/ZnSOD2,CAT2,GPX2基因的表達發(fā)生下調(diào)。此外,在施加外源ABA的條件下,OE系較野生型的生長總是被促進的,表現(xiàn)出對ABA的不敏感性,對ABA信號通路中的marker gene分析發(fā)現(xiàn)ABI1,ABI2,ABI5的表達上調(diào)。我們推測,ROS信號通路與ABA信號通路可能在TaNRT1.2介導的堿脅迫響應的機制中發(fā)揮重要作用。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋Ｓｔｕｄｅｎｔ�。箦澹簦簦澹螅簦澹幔翦澹校迹埃埃靛澹幔睿溴澹校迹埃埃保义辖�(jīng)過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在２００邋ｍＭ邋ＮａＣＩ處理下，親本ＪＮ１７７與ＳＲ３的葉片中，逡逑Ｔｏ灰／漢７￥６在０－４８ｈ內(nèi)的表達變化均不是很明顯（圖３－１Ａ）；但是在ＪＮ１７７的逡逑根中的表達量在處理后的４８ｈ內(nèi)發(fā)生了明顯地下調(diào)，下調(diào)大約１０逡逑倍（圖３－１Ｂ）；而在ＳＲ３的根中，２００ｍＭＮａＣｌ處理后的０－６ｈ內(nèi)化＃兄０４５逡逑的表達量沒有發(fā)生明顯變化，但是在１２－４８邋ｈ期間，表達量發(fā)生了明顯地上調(diào)，逡逑在１２邋ｈ時上調(diào)的倍數(shù)達到最大，大約為１２倍（圖３－］邋Ｂ）。逡逑在１００ｍＭ堿處理下，％奶漢７必在ＪＮ１７７與ＳＲ３的葉中表達顯著下調(diào)（圖逡逑３－２Ｃ）；在ＪＮ１７７根中０．５ｈ－２４ｈ內(nèi)處于上調(diào)表達，但是４８ｈ后表達發(fā)生了明逡逑顯下調(diào)；而在ＳＲ３根中表達一直上調(diào)且在２４邋ｈ時上調(diào)了大約５倍（圖３－２邋Ｄ）。逡逑在ｌＯＯ＾ＭＡＢＡ處理后

該基因構建到ＰＧＢＫＴ７載體上，轉化酵母菌株ＡＨ１０９，并在Ｔｒｐ／Ｈｉｓ的二缺培逡逑養(yǎng)基上培養(yǎng)。逡逑如圖３－４所示，轉化了邋ＴａＷＲＫＹ４６－ｐＧＢＫＴ７或ｐＧＢＫＴ７空載質粒的酵母可逡逑以在Ｔｒｐ單培養(yǎng)基上生長，但只有轉化了邋ＴａＷＲＫＹ４６－ｐＧＢＫＴ７的酵母可以在逡逑Ｔｒｐ／Ｈｉｓ二缺培養(yǎng)基上正常生長。這一結果是由于ＴａＷＲＫＹ４６激活結構域與逡逑ＰＧＢＫＴ７載體上的ＤＮＡ結合結構域共同作用，激活了下游基因的表達，從而賦逡逑予酵母在缺Ｈｉｓ的培養(yǎng)基上生長的能力。以上證據(jù)表明：ＴａＷＲＫＹ４６具有體外逡逑轉錄激活活性。逡逑１邋ｌ0ｘ邋ｌ00ｘ邋ｌＱＱＱｘ邐１邋ｌ0ｘ邋ｌ00ｘ邋ｌ000ｘ逡逑ＴａＷＲＫＹ４６－邋ｆ逡逑ｐＧＢＫＴ７－２逡逑Ｔｒｐ單缺培養(yǎng)基邐Ｔｒｐ／Ｈｉｓ二缺培養(yǎng)基逡逑圖３－４邋ＴａＷＲＫＹ４６體外轉錄激活活性的檢測逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－４邋Ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ＴａＷＲＫＹ４６邋ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ逡逑３．５邐轉基因擬南芥純系的篩選逡逑在各種非生物脅迫下小麥ＳＲ３中７＾股尤７￥６表達發(fā)生了明顯的變化，因此逡逑為了進一步研究該基因在植物響應各種非生物脅迫中的作用，把從ＳＲ３克隆的逡逑必的ＯＲＦ通過酶切連接法構建到ｐＲＩ１０１－ＡＮ載體上，該載體可以使目逡逑的基因在雙子葉植物中高效而且穩(wěn)定表達。經(jīng)過篩選得到Ｔ３代的純系過表達植逡逑株，提取野生型與過表達系的ＲＮＡ，經(jīng)過反轉錄得到ｃＤＮＡ，利用ｑＲＴ－ＰＣＲ檢逡逑測該基因在過表達系中的表達量，挑取兩個表達量較高的轉基因株系（ＯＥ１，逡逑ＯＥ２）用于后續(xù)功能研究（圖３－５）。逡逑２３逡逑

邐山東大學碩士學位論文邐逡逑外源ＡＢＡ的響應過程，我們對過表達株系在對照與不同濃度ＡＢＡ脅迫處理下逡逑的生長狀況進行觀察，發(fā)現(xiàn)對照條件下的野生型與過表達系生長一致，在４邋ｐＭ、逡逑５邋ｐＭ、６邋＾ＭＡＢＡ處理下過表達系的葉片面積沒有差異，但是主根長度明顯比逡逑野生型短。從以上結果推測７＾＾１７４６導致了擬南芥對ＡＢＡ敏感（圖３－７），逡逑可能在調(diào)控植物對ＡＢＡ脅迫的響應中發(fā)揮作用。逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 ;The alkaline tolerance in Arabidopsis requires stabilizing microfilament partially through inactivation of PKS5 kinase[J];遺傳學報;2011年07期

2 江文波;余迪求;;擬南芥WRKY2轉錄調(diào)控因子可能參與調(diào)控滲透脅迫反應[J];云南植物研究;2009年05期

3 石德成;殷立娟;;鹽(NaCl)與堿(Na_2CO_3)對星星草脅迫作用的差異[J];Journal of Integrative Plant Biology;1993年02期

相關博士學位論文 前1條

1 孟晨;小麥漸滲系山融4號根系堿脅迫響應轉錄組及相關基因功能研究[D];山東大學;2015年

本文編號：2824638