【摘要】：花生果腐病是花生生產(chǎn)上的一種主要病害,對(duì)花生的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。近年來此病在我國(guó)北方產(chǎn)區(qū)有連年加重之勢(shì)。目前對(duì)花生果腐病的研究主要集中于對(duì)已知病原菌的分類和鑒定上,對(duì)于近幾年果腐病多發(fā)的山東萊西地區(qū)的致病真菌的分離與鑒定卻少有報(bào)道,有關(guān)花生響應(yīng)果腐病的機(jī)理研究也鮮有報(bào)道。本研究以花生果腐病根際土壤和感病花生為材料,利用454 FLX+測(cè)序技術(shù)分離了萊西地區(qū)果腐病病原真菌;以感病前后的花生籽仁為樣品,利用轉(zhuǎn)錄組和miRNA測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了花生響應(yīng)果腐病相關(guān)基因和miRNA的表達(dá)變化圖譜,并且篩選了關(guān)鍵基因AhMAKK4進(jìn)行基因克隆和抗性分析等研究。通過這些研究,可以有目的性的分離病原真菌,克隆花生響應(yīng)果腐病過程的關(guān)鍵基因及miRNA,為利用基因工程改良花生抗病性提供病原材料和理論基礎(chǔ)。本研究取得主要結(jié)果如下:(1)利用454 FLX+測(cè)序技術(shù)分離了萊西地區(qū)花生果腐病土壤中的病原真菌。測(cè)序得到真菌ITS序列46,723條,注釋得到1,706個(gè)OTUs(Operational Taxonomic Units),其中對(duì)照樣品OTUs共計(jì)1206個(gè),果腐病樣品中OTUs共計(jì)974個(gè),對(duì)照樣品和果腐病樣品中共有的OTUs數(shù)量是474個(gè)。真菌OTUs可以分類到6個(gè)門,24個(gè)綱,272個(gè)屬。分類到種的水平上,物種豐度最高的真菌是Fusarium sp.OreYA。RDA(Redundancy analysis)分析發(fā)現(xiàn)花生品種、環(huán)境因子和病原真菌之間存在密切的相關(guān)性。這些分析表明,花生感染果腐病之后土壤真菌數(shù)量下降,而且其結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)受到土壤環(huán)境因子和花生品種的共同影響,且在萊西地區(qū)果腐病病原真菌以鐮孢菌為主。從花生果腐病土壤中分離出4種未知真菌,從感病花生上分離到1種鐮孢菌�；ㄉ酌绾碗x體組織接種該鐮孢菌發(fā)現(xiàn),幼苗活體和離體組織均被其侵染并發(fā)病,這表明該鐮孢菌可能是花生果腐病的致病真菌。(2)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到花生響應(yīng)果腐病相關(guān)的基因表達(dá)變化圖譜。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共計(jì)得到Unigene 60,756個(gè),其中差異表達(dá)基因共計(jì)14,482個(gè),表達(dá)量上調(diào)的基因10,147,下調(diào)的基因4,334個(gè)。qRT-PCR檢測(cè)了21個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢(shì),其結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。GO富集分析差異表達(dá)基因被分類到24種細(xì)胞組分,5種分子功能和23種生物過程中。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析發(fā)現(xiàn)有4,291個(gè)差異基因被注釋到34條代謝通路中,其中70個(gè)差異表達(dá)基因參與多種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,50個(gè)差異表達(dá)基因參與植物-病原菌互作途徑,17個(gè)差異表達(dá)基因參與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這些分析表明在花生響應(yīng)果腐病過程中存在大量差異表達(dá)基因,推測(cè)其抗病過程是多基因共同作用的結(jié)果。(3)篩選得到花生響應(yīng)果腐病相關(guān)的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和關(guān)鍵基因。在水楊酸介導(dǎo)的抗病途徑中,2個(gè)NPR1基因在果腐病樣品中表達(dá)量下調(diào);5個(gè)TGA基因在果腐病樣品中表達(dá)量下調(diào),而PR基因在兩樣品中表達(dá)量沒有明顯變化。在茉莉酸介導(dǎo)的抗病途徑中,2個(gè)JAR1基因在對(duì)照樣品中表達(dá)量上調(diào),而JAZ在果腐病樣品中表達(dá)量下調(diào)。在乙烯介導(dǎo)的抗病途徑中,1個(gè)ETR基因在對(duì)照樣品中表達(dá)量上調(diào),而2個(gè)EIN3和1個(gè)EBF1-2基因在對(duì)照樣品中表達(dá)量下調(diào)。這說明果腐病病原菌入侵花生時(shí),可能是茉莉酸的含量上升降解了JAZ促使下游的轉(zhuǎn)錄因子EIN3和EBF1-2等的表達(dá)起始轉(zhuǎn)錄。在生長(zhǎng)素介導(dǎo)的信號(hào)途徑中,3個(gè)GH3基因在果腐病樣品中表達(dá)量上調(diào),6個(gè)IAA基因在對(duì)照樣品中表達(dá)量上調(diào)。這說明花生響應(yīng)果腐病與內(nèi)源激素變化有很大關(guān)系,通過分析關(guān)鍵基因的表達(dá)變化圖譜,推測(cè)花生可能通過JA/ET介導(dǎo)的抗病途徑來抵抗果腐病病原菌的侵染。(4)利用小RNA測(cè)序分析得到花生響應(yīng)果腐病過程中miRNAs的表達(dá)變化圖譜。miRNA測(cè)序共獲得了334個(gè)miRNAs,其中有97個(gè)miRNAs在果腐病脅迫后表達(dá)量下調(diào),27個(gè)miRNAs在果腐病脅迫后表達(dá)量上調(diào)。qRT-PCR檢測(cè)了15條miRNA的表達(dá)趨勢(shì),絕大多數(shù)的miRNA表達(dá)趨勢(shì)與sRNA測(cè)序結(jié)果一致,這表明miRNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。對(duì)mi RNAs做靶基因預(yù)測(cè),有303個(gè)miRNAs預(yù)測(cè)到1,998個(gè)靶基因和2,646個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)。119個(gè)差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)到152個(gè)靶基因。這說明,在花生響應(yīng)果腐病的過程中產(chǎn)生不同的miRNA,其表達(dá)趨勢(shì)也不同,而且同一個(gè)miRNA可以靶標(biāo)多個(gè)基因,可能存在多個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)。(5)轉(zhuǎn)錄組和miRNA測(cè)序的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)受10個(gè)miRNA所調(diào)控的14個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中均可以檢測(cè)到。同時(shí)還檢測(cè)到4個(gè)miRNA和其靶基因間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。這說明miRNA通過負(fù)調(diào)控靶基因參與花生響應(yīng)果腐病的分子調(diào)控過程。(6)篩選出抗病關(guān)鍵基因AhMKK4,進(jìn)行基因克隆和表達(dá)分析研究。克隆得到AhMKK4基因,其序列全長(zhǎng)1,434bp,含有3'非編碼區(qū)151bp,5'非編碼區(qū)317bp,開放閱讀框全長(zhǎng)966bp,編碼一條含有322個(gè)氨基酸的蛋白序列。預(yù)測(cè)其分子量為36.74kDa,屬于MAPKK基因家族D組成員。亞細(xì)胞定位顯示AhMKK4基因定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在根中表達(dá)量高于其他組織,具有組織表達(dá)特異性,受JA誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量上調(diào),受SA誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量下調(diào)。這結(jié)果推測(cè)該基因可能在花生根中參與到JA介導(dǎo)的抗病過程。(7)花生AhMKK4基因的轉(zhuǎn)基因功能研究。將AhMKK4構(gòu)建在正義植物表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)入擬南芥,經(jīng)篩選驗(yàn)證后,獲得AhMKK4超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥。繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因擬南芥到T_2,進(jìn)行非生物脅迫下的抗性分析。獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥,在非生物脅迫下的抗性分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株不具備鹽、滲透等抗性,在ABA、JA、IAA脅迫條件下,根生長(zhǎng)受到抑制。這將為下一步花生中基因功能驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S435.652
【圖文】：

在果腐病 3 個(gè)樣品中共有的 OTUs 共計(jì) 89 個(gè)；而 1L 和 2L 都；2L 和 3L 都含有的 OTUs 共有 130 個(gè)，1L 和 3L 都含有的 O果表明，花生感染果腐病之后土壤中真菌數(shù)量下降，而且在不真菌的變化也有所不同。中的 OTUs 覆蓋度在 97%到 99%之間，樣品稀釋曲線分析顯 6,000 個(gè)時(shí)達(dá)到峰值（圖 2-2），測(cè)序飽和度很高，數(shù)據(jù)可靠。每個(gè)土壤樣品的真菌組成都很豐富，均勻程度很高。進(jìn)一步對(duì)樣性分析：群落豐富度指數(shù) Chao1（59.82-72.84%）和 ACE（4樣品的物種群落豐富度不同；群落多樣性指數(shù) Shannon 和 Simp的土壤樣品中，物種多樣性明顯降低，而且在花生品種 2 中，最高，而果腐病樣品物種群落豐富度最低（表 2-2）。這些結(jié)果物種群落豐富度差異。

圖 2-2 6 個(gè)土壤樣品的稀釋曲線顯示測(cè)序強(qiáng)度與 OTUs 的數(shù)量關(guān)系分析C：是對(duì)照樣品，L：是果腐病樣品；1、2、3：3 個(gè)花生品種。arefaction curves showing the relationship between sampling intensity and the number of recovered opertaxonomic units (OTUs) from soil of a peanut pod rot field at harvest timeC: the control sample; L: the pod rot sample. 1, 2, 3: the three cultivars.表 2-2 樣品 454 FLX+測(cè)序的序列信息及 OTUs 的豐度及多樣性分析 Information of sequences obtained and OTUs richness and diversity index for 454 FLX+ pyrosequencingsoil samplesOTU，操作分類單元；a 利用 mothur 軟件，基于標(biāo)準(zhǔn)化的序列的 3%遺傳水平進(jìn)行計(jì)算。1C 1L 2C 2L 3C 3LNo.ofhighqualitysequences8992 8800 8504 6525 7575 6327OTUscoverage（%）99 98 97 97 97 97ObservedOTUsa506 297 649 478 585 505Chao1766 425 891 799 847 805ACE869 497 889 1008 987 909Shannona4 3.85 5.05 3.58 4.53 4.48Simpsona0.08 0.05 0.02 0.11 0.04 0.03

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文（Zygomycota），約占總序列數(shù)的 3.34%；525 個(gè) OTUs 并沒有分類到任未知真菌序列，約占總序列數(shù)的 30.77%。另外，16 個(gè) OTUs 分類到寄他動(dòng)物身上的后鞭毛真核生物（Ichtyosporea）；剩余的95個(gè)OTUs在Ge同源序列。菌類群在花生的 3 個(gè)品種的 6 個(gè)樣品中分類和數(shù)量明顯不同。將每個(gè)樣繪制成柱狀圖，如圖 2-3 所示：與對(duì)照樣品相比，子囊菌門和擔(dān)子菌門，而未知真菌的數(shù)量顯著下降；在品種 2 中，相比對(duì)照，果腐病土壤樣量明顯下降；接合菌門的數(shù)量在果腐病樣品 1 中上升，而在果腐病樣品在 NCBI 上沒有同源序列的 95 個(gè) OTUs 數(shù)量在果腐病樣品 1 和 3 中上升品 2 中明顯下降。這些結(jié)果表明，真菌組成結(jié)構(gòu)存在很大的樣品間差異

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 尹同萍;張錫賢;杜英杰;高林旭;;草莓果腐病的田間診斷與防治[J];山東蔬菜;2003年03期

2 張露茜;劉靜遠(yuǎn);徐飛;焦彬彬;于翠;楊翠云;;進(jìn)境新西蘭獼猴桃中獼猴桃果腐病菌的檢測(cè)與鑒定[J];植物檢疫;2017年04期

3 M.N.L.Sastry;梁少新;;檳榔果腐病的防治[J];熱帶作物譯叢;1989年06期

4 王金友;;梨的新病害“果腐病”[J];山西果樹;1985年04期

5 ;草莓果腐病和根腐病的綜合防治[J];吉林蔬菜;2017年03期

6 王春偉;王燕;張曦倩;張作剛;王美琴;王建明;;越橘鐮孢果腐病菌的生物學(xué)特性測(cè)定及防治藥劑初步篩選[J];園藝學(xué)報(bào);2017年08期

7 張國(guó)裕;張帆;姜立綱;翟偉卜;李海真;;西葫蘆細(xì)菌性果腐病種子帶菌檢測(cè)及消毒[J];中國(guó)蔬菜;2012年06期

8 周黎;丁建軍;戴志新;;西瓜種子生產(chǎn)中果腐病的防治技術(shù)[J];北方園藝;2011年04期

9 丁建軍,周黎,陳先榮,周志成,王葉筠,劉芳政,顧安群;不同藥劑對(duì)細(xì)菌性果腐病的抑菌效果測(cè)試初報(bào)[J];中國(guó)西瓜甜瓜;2005年02期

10 王衛(wèi)芳;胡佳;崔汝強(qiáng);鐘國(guó)強(qiáng);胡學(xué)難;李新芳;黃益燕;;進(jìn)境水果重要真菌病害——星裂殼孢梨果腐病和蘋果果腐病[J];植物檢疫;2009年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 趙仁君;周志成;馮孝立;王葉筠;;瓜類細(xì)菌性果腐病的防治與健康種子生產(chǎn)[A];紀(jì)念全國(guó)西瓜甜瓜科研與生產(chǎn)協(xié)作50周年暨第12次全國(guó)西瓜甜瓜學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2009年

2 常春梅;苗連合;;花生果腐病綜合防治技術(shù)[A];河南省植保學(xué)會(huì)第十次、河南省昆蟲學(xué)會(huì)第九次、河南省植病學(xué)會(huì)第四次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2013年

3 何毅;李文信;洪日新;覃斯華;黃金艷;李天艷;;西瓜嫁接育苗細(xì)菌性果腐病綜合防治措施[A];第13次全國(guó)無籽西瓜科研與生產(chǎn)協(xié)作組會(huì)議論文集[C];2010年

4 李鵬;古勤生;彭斌;安水新;霍志幫;李相濤;唐樂塵;李莉;楊渡;Norman W．Schaad;;西瓜細(xì)菌性果腐病病種子帶菌試驗(yàn)和發(fā)病因素的研究[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

5 張瓊;鄧大成;嚴(yán)欽平;楊紅波;;西瓜雜交制種中細(xì)菌性果腐病的預(yù)防措施探討[A];紀(jì)念全國(guó)西瓜甜瓜科研與生產(chǎn)協(xié)作50周年暨第12次全國(guó)西瓜甜瓜學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2009年

6 趙遠(yuǎn)征;劉志恒;李俞濤;;大櫻桃黑斑果腐病病原菌生物學(xué)特性初步研究[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

7 古勤生;徐永陽;彭斌;徐志紅;劉麗鋒;李莉;;河南西瓜甜瓜發(fā)生細(xì)菌性果腐病[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

8 古勤生;;淺談無子西瓜細(xì)菌性果腐病的防控[A];第13次全國(guó)無籽西瓜科研與生產(chǎn)協(xié)作組會(huì)議論文集[C];2010年

9 趙遠(yuǎn)征;劉志恒;李俞濤;;中國(guó)大櫻桃新病害——鏈格孢黑斑果腐病[A];2012年中國(guó)菌物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)會(huì)議摘要[C];2012年

10 古勤生;李鵬;鄭文杰;彭斌;唐樂塵;楊渡;Norman W．Schaad;;河南省西瓜甜瓜細(xì)菌性果腐病病原細(xì)菌的分離與鑒定[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 王迪軒;嚴(yán)防茄子霉果腐病[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2017年

2 劉士宣 劉艷玲;早防花生果腐病[N];河北科技報(bào);2015年

3 ;根霉果腐病[N];河南科技報(bào);2004年

4 劉光偉;絲瓜果腐病防治方法[N];河北科技報(bào);2015年

5 定州市農(nóng)業(yè)局 王虎;防治花生果腐病抓好5點(diǎn)[N];河北農(nóng)民報(bào);2014年

6 王虎;花生果腐病防治要抓五點(diǎn)[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2014年

7 樂亭縣農(nóng)牧局 張瑞祥;春棚甜瓜果腐病的綜合防治[N];河北科技報(bào);2013年

8 宰雪梅;花生嚴(yán)防果腐病[N];山東科技報(bào);2015年

9 水清;西瓜細(xì)菌性果腐病防治方法[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2008年

10 程海;“西域”引進(jìn)才智振興種業(yè)[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王冕;花生應(yīng)答果腐病病原菌侵染的轉(zhuǎn)錄組和miRNAs研究及抗性相關(guān)基因克隆[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 李鵬;瓜類細(xì)菌性果腐病病原菌鑒定和生物學(xué)特性的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2006年

2 趙遠(yuǎn)征;大櫻桃黑斑果腐病病原學(xué)及防治基礎(chǔ)研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 寇明明;西瓜種子采后處理對(duì)抑制細(xì)菌性果腐病的影響[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

4 歐陽慧;抗獼猴桃果腐病西姆芽孢桿菌的分離鑒定及抑菌活性的初步研究[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 陳全;新疆阿勒泰地區(qū)哈密瓜細(xì)菌性葉枯病和果腐病的病原鑒定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

6 孫飛龍;北五味子3種病害的病原菌鑒定及有效藥劑篩選[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2805452