【摘要】：目前,精準醫(yī)療在我國迅速發(fā)展,而挖掘疾病的致病基因,探索基因的功能,了解其致病機理,是邁向精準醫(yī)療需要經(jīng)歷的過程。遺傳家系資源為探索致病基因和疾病之間的關(guān)系提供了寶貴的證據(jù)支持。過去對孟德爾遺傳疾病的分析是采用全基因組家系連鎖分析進行精細定位、候選基因Sanger測序驗證的方法。然而由于受譜系資料完整度、疾病外顯率、延遲顯性以及分子標記多態(tài)性的影響,往往找不到目標區(qū)域、定位區(qū)域錯誤或不精確。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn),加速了致病基因的發(fā)現(xiàn)。本項研究基于全外顯子組測序技術(shù),鑒定了兩個孟德爾遺傳疾病家系的致病基因及突變,并對基因及其突變的功能進行了研究,強調(diào)了測序技術(shù)與臨床檢查相輔相成,對探究基因——表型的重要性,提出了新的致病分子機制,為疾病的精準醫(yī)療提供了新的啟示。本研究的第一部分對一個具有早發(fā)性病態(tài)竇房結(jié)綜合征(sick sinus syndrome,SSS)、心臟傳導系統(tǒng)障礙(cardiac conduction disorder,CCD)、擴張性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)和心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)的三代家族進行兩次隨訪,發(fā)現(xiàn)該家系患者猝死率高(60%),患者猝死時年齡低,最低年齡30歲,平均年齡39歲,患者疾病進程存在臨床異質(zhì)性。對家系成員采用全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)進行致病基因和突變的鑒定。確定了核纖層蛋白A/C(lamin A/C,LMNA)基因(NM_170707.3/NM_005572.3)中的新型移碼突變LMNA(c.1433dupT,p.Leu478Phefs*74)是引起該家系患者心臟疾病的致病突變。LMNA基因移碼突變引起疾病的分子機制并不完全清楚。本研究通過氨基酸預測分析,認為該移碼突變可能引起lamin A/C產(chǎn)生截短蛋白,引起免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域的破壞。通過全細胞膜片鉗技術(shù),在HEK/Na_v1.5細胞中過表達LMNA(c.1433dupT)突變質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)與野生型lamin A相比LMNA(c.1433dupT)表達的截短蛋白可引起鈉電流密度顯著降低,而恢復、激活、失活曲線均沒有變化。首次發(fā)現(xiàn)其機制是引起細胞膜上Na_v1.5離子通道數(shù)量顯著減少,對全細胞中Na_v1.5離子通道數(shù)量沒有影響。共聚焦熒光顯微鏡顯示LMNA截短蛋白定位發(fā)生變化,呈小點狀聚集在細胞核內(nèi)部且細胞核形態(tài)受影響呈擠壓狀,核周圍皺縮。本研究鑒定了一例LMNA新型移碼突變,引起家族性常染色體顯性遺傳性SSS、CCD、DCM以及SCD。綜合以上結(jié)果,本研究認為該LMNA移碼突變產(chǎn)生的截短蛋白p.Leu478Phefs*74具有負顯性效應,包括影響鈉電流密度、細胞膜上Na_v1.5離子通道數(shù)量、影響lamin A/C自身的組裝分布以及細胞核結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這些負顯性效應和單倍劑量不足可能共同引起了疾病的發(fā)生發(fā)展,這對于理解LMNA基因的臨床異質(zhì)性、引起多種心律失常和猝死提供了解釋,具有重要意義。本研究的第二部分對一個11人的Amish家族進行分析,發(fā)現(xiàn)3個兄妹在新生兒期患有嚴重的眼睛疾病,癥狀表現(xiàn)為畏光、眼球震顫和視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良,并且疾病以常染色體隱性方式遺傳。采用全基因組連鎖分析和全外顯子組測序的方法尋找該家系的致病突變。首先,在基因組上每隔10 cM選擇1個微衛(wèi)星標記(simple sequence repeat,SSR),對406個SSR標記進行了全基因組連鎖分析,在2q11區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個顯著相關(guān)的多態(tài)標記D2S2216,2點LOD值為1.95,多點LOD值為3.76(達到顯著連鎖水平)。通過單體型分析發(fā)現(xiàn),與疾病表型共分離的區(qū)域位于2p14-2q14之間。之后,對家系中3個患者進行全外顯子組分析,發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白和CBS結(jié)構(gòu)域二價金屬陽離子運輸調(diào)節(jié)因子4基因(cyclin and CBS domain divalent metal cation transport mediator 4,CNNM4),存在一例純和無義突變(c.1813CT,p.R605X),并且該基因也位于2p14-2q14區(qū)域。由于CNNM4基因突變在此之前報道導致Jalili綜合征,而在最初的家系收集和臨床診斷檢查時并沒有注意到牙齒病變的癥狀,當鑒定出Jalili綜合征致病基因CNNM4突變之后,對家系成員進行了回訪,發(fā)現(xiàn)患者均具有牙齒畸形的癥狀,符合Jalili綜合征的臨床表型。該CNNM4(p.R605X)突變是在Amish人群中首次報道的具有奠基者效應(founder effect)的突變。Jalili綜合征的致病分子機制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)CNNM4和IQCB1相互作用,而IQCB1突變后會導致先天性黑朦(Leber Congenital Amaurosis,LCA)。截短的CNNM4蛋白(p.R605X)顯著地增強了和IQCB1的相互作用,并增加了細胞凋亡。推測CNNM4(p.R605X)引起Jalili綜合征可能是通過以下幾種途徑之一或者共同作用:無義介導的mRNA降解機制、影響IQCB1的功能以及引起細胞凋亡。本研究首次將Jalili綜合征致病基因CNNM4和LCA致病基因IQCB1在功能水平聯(lián)系起來,這對于解析Jalili綜合征視網(wǎng)膜病變的分子致病機制具有重要的意義。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R596
【圖文】：

圖1. SOLiD 測序平臺基本流程（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/）Figure 1. SOLiD sequence platform and process flowcha （ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/）雙堿基編碼原理如圖 2b 所示。進行連接測序反應時，結(jié)合在芯片玻璃表面 1 μm的磁珠提供足夠的信號，由連接酶介導退火反應，引物與片段的接頭序列連接。每一輪反應，DNA 連接酶連接特異的熒光標記的 8mer，每一個連接步驟后被熒光檢測，接著再生去除 8mer 上的堿基（包括熒光基團）同時準備延伸反應，進行下一輪連接反應。每個堿基通過兩個獨立的探針匹配兩次，被測序兩次，通過連接在 8mer 上的熒光基團可識別兩堿基組合，所以將各個讀長和已知的高質(zhì)量參考序列比對，可篩選出序列。測序錯誤的情況是兩個獨立探針在同一個位置堿基均讀取錯誤并且讀出錯誤的堿基也一致的組合概率，因此保障了測序的準確性[8]。

圖2. SOLiD 測序儀連接測序反應及雙堿基編碼原理[8]Figure 2. The ligase-mediated sequencing approach and principles of two-base encoding of theSOLiD sequencer[8]1.3 鈉離子通道與遺傳性心律失常心臟傳導系統(tǒng)控制心臟有節(jié)律地收縮和舒張，將血液泵送至全身。心臟傳導系統(tǒng)包括：竇房結(jié)（sino-atrial node，SAN）、結(jié)間束、房室結(jié)(atrioventricular node，AV)、希氏束和浦肯野纖維（His-Purkinje）系統(tǒng)。SAN 于 1907 年發(fā)現(xiàn)，其中含有特化的 P細胞，生理條件下是心臟的起搏點，控制心率，引起動作電位，使興奮在心臟中傳導[12]。AV 中含有慢傳導細胞，在心房和心室收縮之間產(chǎn)生延遲。His-Purkinje 中可進行快速傳導保障心室細胞同步收縮。心肌細胞具有自律性、興奮性和傳導性這 3 個特點，這是由細胞膜電位特征決定的[13]。心肌細胞的鈉離子、鈣離子、鉀離子對于心肌細胞膜電位重要，心肌細胞動作電位需要各種離子通道的有序配合，通道順序開放并保持動態(tài)平衡是心臟正常

[14]。圖3. 心臟離子通道在心肌動作電位（AP）中的作用示意圖[13]Figure 3. A schematic representation of the cardiac action potential (AP)[13]自 1995 年，Wang 等首次將離子通道基因 SCN5A 突變和家族性遺傳性心律失�！L QT 綜合征（LQT syndrome 3，LQT3）關(guān)聯(lián)起來[15]，開啟了離子通道相關(guān)基因在遺傳性心律失常研究的大門。隨后其帶領的科研團隊對有原發(fā)性心室纖維顫動（IVF）病史的家系成員進行遺傳連鎖分析，發(fā)現(xiàn) SCN5A 基因變異的錯義突變和移碼突變，影響鈉離子通道的激活和失活[16]。SCN5A 基因編碼心臟電壓門控鈉離子通道 α 亞基 Nav1.5，定位于 3p21。SCN5A基因全長 80 kb，包含 28 個外顯子。除 LQT3、IVF 外

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