【摘要】：目的:研究間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)對經(jīng)鞘氨醇激酶1(sphigosine kinase 1,SphK1)基因沉默的人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖和遷移的影響,并探討其可能機(jī)制。方法:采用來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液(MSC-CM)和對照培養(yǎng)液(Control-CM)分別干預(yù)RKO細(xì)胞,分為RKO+MSC-CM組、RKO+Control-CM組,利用CCK8法檢測細(xì)胞的增殖能力,Transwell試驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力,Western blot法檢測增殖標(biāo)志物Ki-67、遷移標(biāo)志物MMP-2和MMP-9、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD133的蛋白表達(dá)水平。采用慢病毒載體感染RKO細(xì)胞使其SphK1基因沉默,分為SphK1基因沉默組(SphK1(-)-RKO組)、陰性對照轉(zhuǎn)染組(NC-RKO組),未轉(zhuǎn)染的野生型細(xì)胞為空白對照組(wild-RKO組)。于光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下分別觀察三組細(xì)胞的形態(tài)和綠色熒光顆粒攜帶情況,Western blot法檢測三組細(xì)胞的SphK1蛋白表達(dá)情況,CCK8法和Transwell試驗(yàn)分別檢測三組細(xì)胞的增殖和遷移能力。用MSC-CM和Control-CM分別干預(yù)SphK1(-)-RKO、NC-RKO細(xì)胞,分為SphK1(-)-RKO+MSC-CM組、SphK1(-)-RKO+Control-CM組、NC-RKO+MSC-CM組和NC-RKO+Control-CM組。檢測方法同RKO+MSC-CM組、RKO+Control-CM組。觀察MSC-CM對經(jīng)SphK1基因沉默的RKO細(xì)胞增殖和遷移能力以及MMP-2、MMP-9、CD44和CD133蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果:CCK8結(jié)果顯示,RKO+MSC-CM組細(xì)胞的增殖能力時(shí)間依賴性高于RKO+Control-CM組。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RKO+MSC-CM組的遷移細(xì)胞顯著多于RKO+Control-CM組[(477.00±18.36)vs(280.80±15.53),P0.01]。說明MSC-CM能明顯促進(jìn)RKO細(xì)胞的增殖和遷移。Western blot檢測結(jié)果表明,RKO+MSC-CM組Ki67、MMP-2、MMP-9、CD44和CD133蛋白表達(dá)量均高于RKO+Control-CM組[Ki67:(1.23±0.06)vs(0.95±0.07),MMP-2:(0.87±0.06)vs(0.67±0.04),MMP-9:(0.97±0.06)vs(0.82±0.06),CD44:(1.74±0.05)vs(1.36±0.06),CD133:(0.90±0.03)vs(0.75±0.06),均P0.05或P0.01]。說明MSC-CM可增加RKO細(xì)胞中上述腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。在光學(xué)顯微鏡下觀察SphK1(-)-RKO、NC-RKO、wild-RKO組細(xì)胞未見明顯差異,但在熒光顯微鏡下可見SphK1(-)-RKO組和NC-RKO組細(xì)胞攜帶綠色熒光顆粒,而wild-RKO組細(xì)胞無綠色熒光顆粒。Western blot結(jié)果顯示,SphK1(-)-RKO組細(xì)胞SphK1蛋白表達(dá)水平較wild-RKO組和NC-RKO組明顯下降[(0.56±0.05)vs(1.25±0.06)和(1.20±0.09),均P0.01],表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SphK1低表達(dá)的RKO細(xì)胞。CCK8法檢測結(jié)果顯示,SphK1(-)-RKO組細(xì)胞的增殖能力較wild-RKO組和NC-RKO組明顯下降。Transwell結(jié)果表明,SphK1(-)-RKO組細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于wild-RKO組和NC-RKO組[(92.20±18.96)vs(279.40±20.34)和(276.20±24.44),均P0.01]。表明下調(diào)SphK1可抑制RKO細(xì)胞的增殖和遷移。CCK8法檢測結(jié)果顯示,NC-RKO+MSC-CM組細(xì)胞增殖能力明顯較NC-RKO+Control-CM組細(xì)胞增強(qiáng),而SphK1(-)-RKO+MSC-CM組和SphK1(-)-RKO+Control-CM組細(xì)胞增殖無明顯差異。Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn),NC-RKO+MSC-CM組遷移細(xì)胞數(shù)明顯多于NC-RKO+Control-CM組[(473.20±19.06)vs(274.20±21.05),P0.01]。而SphK1(-)-RKO+MSC-CM組遷移細(xì)胞數(shù)和SphK1(-)-RKO+Control-CM組沒有顯著差異[(94.20±14.15)vs(86.00±15.38),P0.05]。表明抑制SphK1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)MSC-CM對RKO細(xì)胞的增殖和遷移的促進(jìn)作用。Western blot檢測結(jié)果顯示,NC-RKO+MSC-CM組的腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)較NC-RKO+Control-CM組顯著增強(qiáng)[Ki67:(1.22±0.06)vs(0.94±0.07),MMP-2:(0.88±0.04)vs(0.68±0.05),MMP-9:(0.97±0.05)vs(0.79±0.04),CD44:(1.74±0.06)vs(1.36±0.06),CD133:(0.95±0.04)vs(0.73±0.07),均P0.01]。而SphK1(-)-RKO+MSC-CM組與Sph K1(-)-RKO+Control-CM組無明顯差異[Ki67:(0.68±0.04)vs(0.64±0.05),MMP-2:(0.57±0.04)vs(0.49±0.04),MMP-9:(0.61±0.05)vs(0.59±0.04),CD44:(0.88±0.04)vs(0.85±0.05),CD133:(0.60±0.05)vs(0.59±0.06),均P0.05]。表明抑制SphK1可逆轉(zhuǎn)MSC-CM對RKO細(xì)胞中Ki67、MMP-2、MMP-9、CD44和CD133蛋白的上調(diào)作用。結(jié)論:MSC可促進(jìn)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖和遷移,但對經(jīng)Sph K1基因沉默的RKO細(xì)胞增殖和遷移無明顯影響,且下調(diào)SphK1可以通過抑制MMP-2、MMP-9、CD44和CD133的表達(dá)逆轉(zhuǎn)MSC對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34
【圖文】：

業(yè)論文 間充質(zhì)干細(xì)胞對經(jīng) SphK1 基因沉默的 RKO 細(xì)胞增殖和結(jié) 果CM 對結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞增殖的影響腸癌 RKO 細(xì)胞分別用 MSC-CM 和 Control-CM 干預(yù)，CCSC-CM 組、RKO+Control-CM 組在 0h、24h、48h、72h、，以干預(yù)時(shí)間作為橫坐標(biāo)，450nm 處的光密度（D450）值制增殖曲線。如圖 1 及表 1 示，培養(yǎng) 24h 后，RKO+MSC50值以時(shí)間依賴性顯著高于 RKO+Control-CM 組（P<0.0M 能夠促進(jìn)結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞的增殖。

圖 2 MSC-CM 對結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞遷移的影響（x200）, **P<0.01Fig. 2 Effects of MSC-CM on the migration of RKO cells (x200), **P<0.013. MSC-CM 對 RKO 細(xì)胞 Ki67、MMP-2/9、CD44 和 CD133 蛋白表達(dá)量的影響Western Blot 結(jié)果顯示，RKO+MSC-CM 組 Ki67、MMP-2/9、CD44 和CD133 蛋白表達(dá)量均高于 RKO+Control-CM 組，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05 或 P<0.01）。說明 MSC-CM 可增進(jìn)結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞中 Ki67、MMP-2/9、CD44 和 CD133 蛋白的表達(dá)。如圖 3 和表 2 所示。

圖 2 MSC-CM 對結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞遷移的影響（x200）, **P<0.01Fig. 2 Effects of MSC-CM on the migration of RKO cells (x200), **P<0.013. MSC-CM 對 RKO 細(xì)胞 Ki67、MMP-2/9、CD44 和 CD133 蛋白表達(dá)量的影響Western Blot 結(jié)果顯示，RKO+MSC-CM 組 Ki67、MMP-2/9、CD44 和CD133 蛋白表達(dá)量均高于 RKO+Control-CM 組，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05 或 P<0.01）。說明 MSC-CM 可增進(jìn)結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞中 Ki67、MMP-2/9、CD44 和 CD133 蛋白的表達(dá)。如圖 3 和表 2 所示。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Fei Ren;Wei-Qi Sheng;Xiang Du;;CD133:A cancer stem cells marker, is used in colorectal cancers[J];World Journal of Gastroenterology;2013年17期

本文編號(hào)：2802826