【摘要】：目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥,但是化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來了一系列的問題,因此使用一種具有特異、高效的生物殺蟲劑蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)占主要地位,它廣泛用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)及醫(yī)學(xué)害蟲的防治,其生產(chǎn)量和使用量占微生物農(nóng)藥的95%以上。蘇云金芽胞桿菌可產(chǎn)生晶體蛋白和可溶性分泌蛋白,并且這些蛋白對靶標(biāo)害蟲具有高效特異的殺蟲活性,因此在全球范圍內(nèi)得到普遍應(yīng)用。正是這種殺蟲蛋白的效用,也促使我們識別和鑒定出具有不同特異性的新的殺蟲蛋白,從而在土壤環(huán)境中分離出更多的新型Bt資源,并且具有殺蟲特性的Cry蛋白已經(jīng)廣泛被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治,但目前仍然有其他的Bt蛋白還未有明確其靶標(biāo)害蟲。近年來由于在我國農(nóng)業(yè)害蟲的逐年加重,農(nóng)作物的產(chǎn)量逐年下降。因此,現(xiàn)在急需尋找新型的殺蟲活性基因這對我國農(nóng)業(yè)害蟲的防治具有非常重要意義。本文針對我國棉田鱗翅目害蟲進行了菌株的篩選與殺蟲基因克隆的研究。本研究的主要內(nèi)容如下:(1)從中國海南地區(qū)采集到2300份土壤,分離出Bt菌株755株,其伴胞晶體類型有長雙錐體形、短雙錐體形、球形等,本實驗根據(jù)已知的基因序列設(shè)計通用引物,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法,對2300株Bt菌株基因池DNA混合樣品進行PCR鑒定。序列分析結(jié)果表明,這些Bt菌株基因池中含有2種cry2類基因,分別為cry2Ab基因和cry2Ag基因,擴增得到cry2Ab和cry2Ag的全長基因序列,分別為1902bp和1891 bp,已提交cry2Ab基因序列(Gen Bank登錄號為KX357382)和cry2Ag基因序列(Gen Bank登錄號為KX236449)。分別構(gòu)建p EB-Cry2Ab和pEB-Cry2Ag表達載體,并在大腸桿菌BL21中成功表達,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果顯示,兩種Cry2類蛋白均可以表達出分子量為70 kDa的殺蟲晶體蛋白。將得到的兩種殺蟲晶體蛋白分別對鱗翅目(Lepidoptera)害蟲小菜蛾(Plutella xylostella)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)進行生物活性的初篩測定,選取初篩活性較高的蛋白再進行復(fù)篩,復(fù)篩結(jié)果顯示,成功表達的兩種蛋白對小菜蛾和棉鈴蟲具有較高的殺蟲活性。(2)對實驗室保存的海南地區(qū)菌株Bt BJH500、Bt BJH498進行基因鑒定,通過PCR鑒定發(fā)現(xiàn)其中含有cry4基因,再利用全長引物進行擴增,結(jié)果獲得cry4-like全長基因序列。該序列已提交Gen Bank注冊,登錄號為KX244950。將得到的全長基因與p EB載體相連,構(gòu)建表達載體在大腸桿菌BL21中成功表達,通過SDS-PAGE結(jié)果顯示,可以在大腸桿菌中表達出分子量為43 kDa的晶體蛋白。將表達得到的晶體蛋白對小菜蛾和棉鈴蟲進行生物活性初步測定,其校正死亡率都較低,結(jié)果分析該蛋白對小菜蛾、棉鈴蟲均無顯著殺蟲活性。本研究針對我們實驗室保存的海南地區(qū)菌株,進行菌株篩選、基因型的鑒定與殺蟲活性的測定,獲得有效菌株Bt BJH500和Bt BJH498。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法成功克隆殺蟲基因3個。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種Cry2類蛋白對三種鱗翅目(Lepidoptera)害蟲小菜蛾(Plutella xylostella)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有一定的殺蟲活性。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S482.39;Q78
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文最后，同源性高于 95%的蛋白在第四等級里進行類別區(qū)分[18]。不管怎樣，這種法可為每個獨立編碼蛋白的基因序列進行分類，因此，盡管有些蛋白可能在第四但實際上它們的氨基酸序列也可能是相同的[18]。這種命名系統(tǒng)通常用于 Bt 蛋素（Cry 和 Cyt）和分泌蛋白（Vip 和 Sip）的命名與分類。到目前為止，共Cry1-Cry74，Cyt1-Cyt3，Vip1-Vip4，Sip）包括 349 種模式基因。

盡管結(jié)果發(fā)現(xiàn)這九種毒素蛋白的氨基酸序列和殺蟲特異性差別較大，但它們活性區(qū)域卻具有一致的結(jié)構(gòu)：即大部分ICPs的結(jié)構(gòu)域主要包括Domain I、Domain II和Domain III（圖1-3）。Domain I位于活性Cry蛋白的N-末端于1991年由Li等首次報道[30]。它包括一個α-螺旋束，在這個α-螺旋束中，一個疏水的 -螺旋中心由有6個反向平行的 -螺旋圍繞著形成（圖1-3）。有研究認為Domain I會與毒素寡發(fā)生聚化、插入細胞膜以及空洞形成有關(guān)[31]，在Domain Ⅱ中是由三個反向平行的β-折疊構(gòu)成一個β棱柱（ -prism）結(jié)構(gòu)（圖1-3）[30]，其中兩個折疊片暴露在外側(cè)表面的而且是由希臘鑰匙的四條單鏈組成的。這種結(jié)構(gòu)被形象地稱為“Greek Key”拓撲結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由由四個反向平行的 -折疊片段構(gòu)成。還發(fā)現(xiàn)與幼蟲中腸蛋白的特異結(jié)合有關(guān)是暴露在外面的Loop區(qū)域[31]。近年來有研究表明，某些氨基酸的位點或區(qū)域與殺蟲特異性有很大的關(guān)系是因為Cry蛋白的DomainⅡ結(jié)構(gòu)上的Cry毒素結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。Cry毒素結(jié)構(gòu)是DomainⅡ中變化最多的結(jié)構(gòu)域[32]，DomainⅡ的該區(qū)域與免疫球蛋白的相似性足可以表明毒素蛋白的DomainⅡ區(qū)域在與受體結(jié)合中起著非常重要的作用[30]

Bt BJH500 Bt BJH498圖 3-1 光學(xué)顯微鏡下蘇云金芽胞桿菌的晶體形態(tài)Fig. 3-1 The crystal shape of Bt strains under a microcope3.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組提取對從海南地區(qū)篩選出的 755 株標(biāo)準(zhǔn)菌株進行基因組的提取，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖 3-2。從電泳結(jié)果圖中可以看出，提取的基因組質(zhì)量和濃度較高，將提取質(zhì)量高的基因組作為模板用于后續(xù) PCR 擴增實驗。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2757422