本文關(guān)鍵詞：禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其表達(dá)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi(L.)屬于昆蟲(chóng)綱半翅目(Hemiptera)、蚜科(Aphididae),是具有刺吸式口器的重要麥類(lèi)害蟲(chóng)之一,廣泛分布于世界各地。該蟲(chóng)刺吸小麥汁液,使小麥不能灌漿或籽粒不飽滿,造成千粒重下降,而且傳播大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV),每年給世界各地的小麥生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失�；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑噴施是防治禾谷縊管蚜的主要方法,長(zhǎng)期大量使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑已經(jīng)導(dǎo)致該蟲(chóng)對(duì)多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性,面對(duì)強(qiáng)大的殺蟲(chóng)劑選擇壓力,蚜蟲(chóng)通過(guò)基因突變、基因擴(kuò)增、代謝酶活力改變等機(jī)制產(chǎn)生快速的進(jìn)化與適應(yīng)。已有研究表明,ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為一種外排泵,其基因表達(dá)量上升可以降低細(xì)胞內(nèi)部外源物質(zhì)的有效濃度,導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)藥劑的敏感性下降。本研究克隆得到禾谷縊管蚜部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全長(zhǎng)序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析,同時(shí)研究了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米對(duì)農(nóng)藥的增效作用,分析了禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在殺蟲(chóng)劑抗性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用,研究結(jié)果對(duì)于深入闡明禾谷縊管蚜對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制具有重要意義。1.禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其生物信息學(xué)分析本研究采用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆獲得了14個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Rhpa ABCA3,Rhpa ABCB6,Rhpa ABCB7,Rhpa ABCB10,Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG1,Rhpa ABCG4,Rhpa ABCG4-1,Rhpa ABCG5,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20,Rhpa ABCG23,Rhpa ABCG23-1和Rhpa ABCG23-2 c DNA全序列,其中Rhpa ABCG4和Rhpa ABCG4-1與Rhpa ABCG23,Rhpa ABCG23-1和Rhpa ABCG23-2可能是選擇性剪切導(dǎo)致的異構(gòu)體。14個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度依次分別為5 837,2 818,2 337,1 812,5 463,3 074,2 678,2 443,2 437,2 924,3 872,2 383,2 432和2 256 bp,分別編碼1 635,839,683,603,1 514,616,709,629,638,700,811,693,695和686個(gè)氨基酸。在NCBI上Blastp分析發(fā)現(xiàn),這14個(gè)基因編碼的氨基酸序列與豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和麥雙尾蚜Diuraphis noxia對(duì)應(yīng)基因編碼的氨基酸序列一致性最高,達(dá)到90%以上。結(jié)構(gòu)分析表明,14個(gè)蛋白均具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族典型的結(jié)構(gòu)特征,說(shuō)明其均為禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因。通過(guò)ORF finder在線軟件分析顯示,各個(gè)基因均具有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上,14個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與豌豆蚜和麥雙尾蚜各對(duì)應(yīng)蛋白距離最近;禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的兩大支,其中A家族和G家族聚在其中一支,B家族和C家族聚在另外一支;G家族中G20和G23,G1和G4的進(jìn)化關(guān)系較近,G20和G23位于其中一小支,G1和G4位于另一小支。2.禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)模式分析本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對(duì)禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)hpa ABCC1,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20和Rhpa ABCG23在不同品系中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示禾谷縊管蚜Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20和Rhpa ABCG23在禾谷縊管蚜不同品系中均有不同程度的表達(dá);本研究檢測(cè)并分析了這4個(gè)基因在禾谷縊管蚜1-4齡若蚜和無(wú)翅成蚜的表達(dá)變化,結(jié)果顯示這4個(gè)基因在禾谷縊管蚜整個(gè)發(fā)育歷期均有表達(dá),但這4個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)的變化規(guī)律不同;為了明確禾谷縊管蚜多藥耐藥相關(guān)蛋白R(shí)hpa ABCC1在禾谷縊管蚜不同組織的特異性表達(dá)分析,本研究檢測(cè)并分析了禾谷縊管蚜無(wú)翅成蚜足,表皮,頭部和中腸的特異性表達(dá),結(jié)果顯示Rhpa ABCC1在無(wú)翅成蚜4個(gè)不同組織中均有不同程度的表達(dá),其中中腸表達(dá)量最高,為足的4.49倍;此外,本研究檢測(cè)并分析了禾谷縊管蚜敏感種群在毒死蜱和吡蟲(chóng)啉藥劑致死中濃度LC50處理12h、24 h、36 h和48 h后Rhpa ABCC1的相對(duì)表達(dá)量變化,研究結(jié)果表明,兩種藥劑處理后,禾谷縊管蚜Rhpa ABCC1均上調(diào)表達(dá),其中吡蟲(chóng)啉處理48 h后的相對(duì)表達(dá)量與敏感品系差異顯著。3.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米對(duì)殺蟲(chóng)劑增效作用的研究為了確定禾谷縊管蚜對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性是否由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo),我們分別單獨(dú)使用殺蟲(chóng)劑和殺蟲(chóng)劑與維拉帕米的結(jié)合使用對(duì)禾谷縊管蚜進(jìn)行生物測(cè)定。結(jié)果顯示,在終濃度為500μM的維拉帕米下,毒死蜱,異丙威,吡蟲(chóng)啉和氯氟氰菊酯的毒力分別增加2.72倍,1.40倍,1.64倍和1.50倍。此外,在終濃度為500μM的維拉帕米下,毒死蜱和吡蟲(chóng)啉在相應(yīng)藥劑抗性品系中的毒力分別增加1.33倍和1.26倍。
【關(guān)鍵詞】：禾谷縊管蚜 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 基因克隆 表達(dá)分析 殺蟲(chóng)劑抗性 維拉帕米增效
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S435.12
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-30
• 1.1 禾谷縊管蚜12
• 1.2 昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)理12-16
• 1.2.1 代謝抗性的分子生物學(xué)機(jī)制12-14
• 1.2.2 靶標(biāo)抗性的分子生物學(xué)機(jī)制14-16
• 1.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其介導(dǎo)的農(nóng)藥跨膜運(yùn)輸16-29
• 1.3.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制16-19
• 1.3.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族及其生理功能19-21
• 1.3.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在殺蟲(chóng)劑抗性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用21-22
• 1.3.4 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑22-29
• 1.4 研究目的與意義29-30
• 第二章 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其生物信息學(xué)分析30-53
• 2.1 材料與方法30-34
• 2.1.1 供試?yán)ハx(chóng)30
• 2.1.2 主要試劑及儀器30
• 2.1.3 RNA提取30-31
• 2.1.4 c DNA第一鏈的合成31
• 2.1.5 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長(zhǎng)的克隆31-34
• 2.1.6 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的序列分析及分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建34
• 2.2 結(jié)果與分析34-50
• 2.2.1 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與序列分析34-44
• 2.2.2 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析44-50
• 2.3 討論50-53
• 第三章 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)模式分析53-63
• 3.1 材料與方法53-56
• 3.1.1 供試?yán)ハx(chóng)53-54
• 3.1.2 主要試劑54
• 3.1.3 主要儀器54
• 3.1.4 禾谷縊管蚜不同發(fā)育階段RNA提取54
• 3.1.5 禾谷縊管蚜無(wú)翅成蚜不同組織RNA提取54
• 3.1.6 禾谷縊管蚜抗性品系和敏感品系RNA提取54
• 3.1.7 禾谷縊管蚜藥劑誘導(dǎo)處理RNA提取54
• 3.1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)54-55
• 3.1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同處理的禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量55
• 3.1.10 數(shù)據(jù)分析55-56
• 3.2 結(jié)果與分析56-60
• 3.2.1 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因不同發(fā)育時(shí)期相對(duì)表達(dá)量分析56-57
• 3.2.2 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Rhpa ABCC1不同組織相對(duì)表達(dá)量分析57
• 3.2.3 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因不同品系相對(duì)表達(dá)量分析57-59
• 3.2.4 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Rhpa ABCC1吡蟲(chóng)啉和毒死蜱誘導(dǎo)不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量分析59-60
• 3.3 討論60-63
• 第四章 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米對(duì)殺蟲(chóng)劑的增效作用63-67
• 4.1 材料與方法63-64
• 4.1.1 供試?yán)ハx(chóng)63
• 4.1.2 供試藥劑63
• 4.1.3 生物測(cè)定63-64
• 4.1.4 數(shù)據(jù)分析64
• 4.2 結(jié)果與分析64
• 4.3 討論64-67
• 第五章 結(jié)論與展望67-69
• 參考文獻(xiàn)69-81
• 致謝81-82
• 作者簡(jiǎn)介82

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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  本文關(guān)鍵詞：禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及其表達(dá)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：274818