【摘要】：紫杉醇是一種廣譜、高效、低毒的抗癌藥物。產(chǎn)紫杉醇內生真菌是重要的紫杉醇藥源之一。但目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇內生真菌存在紫杉醇產(chǎn)量低等問題,尚無法實現(xiàn)其工業(yè)化應用。高表達真菌的紫杉醇合成限速酶基因和調控基因,構建紫杉醇穩(wěn)定高產(chǎn)的基因工程菌株是實現(xiàn)其工業(yè)化應用的主要途徑之一。但目前真菌紫杉醇合成途徑及其相關基因的研究極少,嚴重限制了高產(chǎn)工程菌株的創(chuàng)建。因此,克隆真菌紫杉醇合成相關基因并研究其功能,已成為利用基因工程技術提高真菌紫杉醇產(chǎn)量的關鍵。本研究以產(chǎn)紫杉醇真菌枝狀枝孢霉(簡稱:枝霉)(Cladosporium cladosporioides)MD2為對象,選取了2個候選基因A11450和A02725,克隆了A02725并對A02725進行了生物信息學分析,分別構建了這兩個候選基因的超表達載體,并獲得相應的轉基因菌株,通過檢測轉基因菌株中紫杉烷類的合成情況,分析了超表達候選基因A11450和A02725對宿主紫杉烷合成的影響,為深入揭示這兩個基因的功能以及高產(chǎn)菌株的構建奠定了基礎。本研究的主要結果如下:(1)克隆了候選基因A02725的DNA全長序列并采用多個在線軟件對其進行了結構和功能預測。候選基因A02725的DNA全長序列為1524 bp,不含內含子,其編碼蛋白與Cercospora zeina的r{牛兒r{牛兒焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)一致性為62%,該蛋白不含跨膜結構,無信號肽,含有聚戊烯基合成(Polypentenyl synthetic)結構域。(2)以pTFCM為基本框架構建了候選基因A11450的超表達載體,采用農桿菌介導法轉化枝霉MD2,成功獲得了A11450-轉基因菌株25株。采用Southern blot技術分析轉基因菌株中外源基因的拷貝數(shù),并隨機選擇了三株外源基因以單拷貝方式整合的A11450-轉基因菌株4-6、4-19及4-20,QRT-PCR檢測候選基因A11450的表達量,然后選取基因表達量相對最高的4-20菌株提取紫杉烷類產(chǎn)物進行了HPLC分析。結果表明,A11450-轉基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇產(chǎn)量是對照菌株(未轉基因菌株)的1.24-1.36倍;說明超表達候選基因A11450可提高枝霉MD2 10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇的產(chǎn)量。(3)構建了候選基因A02725的超表達載體,采用農桿菌介導法轉化枝霉MD2,共獲得A02725-轉基因菌株18株。Southern blot驗證候選基因A02725的拷貝數(shù)。隨機選擇三株外源基因以單拷貝方式整合的A02725-轉基因菌株7-10、7-14及7-18,并采用QRT-PCR檢測候選基因A02725的表達量,結果表明7-18菌株的A02725相對表達量最高。HPLC分析7-18菌株的三種紫杉烷類,結果表明A02725-轉基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇產(chǎn)量是對照菌株的1.34-1.44倍;說明超表達候選基因A02725可提高枝霉MD2的三種紫杉烷類的產(chǎn)量。以上結果初步揭示超表達候選基因A11450和A02725可促進枝霉MD2的三種紫杉烷類的合成,為后期通過基因敲除分析以及體外催化功能分析深入揭示這兩個基因的功能奠定基礎。
【學位授予單位】：中南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q93;Q78

【參考文獻】

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本文編號：2738167