【摘要】：粘蟲Mythimna separata(Walker)隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuide),是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。粘蟲之所以在各地頻繁爆發(fā)以致成災(zāi),與其強大的生殖力和特殊的生殖適應(yīng)性密不可分。圍繞生殖調(diào)控決定生殖潛能與適應(yīng)性這一問題,開展生殖相關(guān)基因的研究是必要的。卵黃原蛋白受體(Vitellogenin receptor,VgR)作為介導(dǎo)脂肪體與卵巢間卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白,對于卵黃的發(fā)生以及卵母細胞的發(fā)育和成熟具有重要作用。因此,開展此基因的相關(guān)研究具有重要的理論意義。本文對粘蟲卵黃蛋白受體VgR基因cDNA全長序列進行了克隆、表達模式的建立以及功能的鑒定,旨在為粘蟲生殖機制提供理論基礎(chǔ)。本文利用反轉(zhuǎn)錄PCR(everse transcription-PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了粘蟲的VgR基因的全長cDNA序列,并對其進行了生物學(xué)信息分析。然后以β-Tubulin作為內(nèi)參基因,運用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技術(shù)建立了該基因在粘蟲不同發(fā)育階段以及不同組織的表達模式,并通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)對VgR基因進行沉默,探究其差異性以進一步確定該基因功能。1.粘蟲VgR基因cDNA全長為5380 bp,開放閱讀框ORF為5328 bp,起始密碼子ATG位于16-18位核苷酸,終止密碼子位于5341-5343位核苷酸,總共編碼1775個氨基酸,分子量大小為198.995 kDa,等電點為5.11。粘蟲VgR包含154個磷酸化位點,16個糖基化位。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明,粘蟲VgR蛋白為低密度脂蛋白受體,缺少O-糖鏈結(jié)構(gòu)域(O-linked carbohydratesdomain,OLSD)。粘蟲VgR蛋白包含兩個配體結(jié)合域(Ligand-binding domain,LBD)和兩個表皮生長因子前體同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)。兩個配體結(jié)合域分別包括4個和7個A型重復(fù)序列(LDLa);其中一個EGFD包括4個B型重復(fù)基序和7個YXTD基序集群,而另一個EGFD由3個B型重復(fù)基序(LDLb)和2個YXTD構(gòu)成。該蛋白存在跨膜區(qū)(Transmembrane domain,TMD),屬于跨膜蛋白。VgR的信號肽位于N端起始位置,由MKYECLILVVLVTWCA EFA這20個氨基酸構(gòu)成。系統(tǒng)發(fā)育樹中,粘蟲VgR與鱗翅目昆蟲聚在一支,與同為夜蛾科的棉鈴蟲Helicoverpa armigera和斜紋夜蛾Spodoptera litura親緣最近。2.本實驗建立了VgR基因在粘蟲雌蛾和幼蟲不同組織中的表達模式。在雌蛾各組織中VgR均有表達,卵巢內(nèi)表達水平顯著高于其它組織,表皮中表達水平最低。在粘蟲幼蟲不同組織中的表達模式中,脂肪體內(nèi)VgR基因相較于頭部、表皮、腸道有顯著表達,但表達量很低。3本實驗建立了VgR基因在雌性粘蟲不同發(fā)育階段的表達模式,結(jié)果表明粘蟲VgR基因主要在成蟲期表達,表達量隨羽化時間總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,于羽化第二天有明顯表達上升,升至第五天達到頂峰,從第六天開始下降。4.本實驗利用RNAi技術(shù)對VgR基因進行干擾,結(jié)果顯示處理組(VgR-dsRNA)VgR基因的表達量于注射后48-60 h明顯低于陰性對照組(GFP-dsRNA),說明干擾有效地抑制了卵黃原蛋白受體的表達。同時,分別將此兩組的雌蛹培養(yǎng)至羽化第三天,然后將其卵巢進行解剖,對比發(fā)現(xiàn),處理組的粘蟲卵巢中卵子的卵黃蛋白的沉積明顯受到抑制,發(fā)育較陰性對照遲緩,與該基因表達量檢測結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：山西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S433.4
【圖文】：

山西師范大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2.1.5 擴增策略及引物設(shè)計與合成基于粘蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，比對篩出 VgR 的預(yù)測序列，然后將該序列分成核心區(qū)域 A、5'末端全長 cDNA 序列 B 以及 3'末端全長 cDNA 序列 C 三部分進行分段克隆(圖 2-1)。首先擴增中間片段，將其分成五部分段（A1、A2、A3、A4及 A5）設(shè)計引物逐步擴增，每個片段之間至少 50bp 重疊區(qū)以保證最終序列的完整。根據(jù)測序得到的核心區(qū)域片段A1和A5分別設(shè)計特異性引物VgR B1、VgR B2以及 VgR C1、VgR C2。5'端全長 cDNA 序列 B 使用引物 VgR B1、VgR B2 與 5'RACE 的接頭引物 5' outer 和 5' inner 進行擴增，VgR C1、VgR C2 和 3' RACE 的接頭引物 3' outer 和 3' inner 則用于進行 3'端全長 cDNA 序列 C 的擴增。將測序后獲得的片段由 ContingExpress 軟件拼接以獲得粘蟲VgR的全長cDNA序列，所用引物見表 1 (表 2-3)。

3 結(jié)果隆檢測說明書步驟提取粘蟲腹部的總 R圖 3-1 所顯示，圖中具有三條清5s，其中 18s 最亮，5s 最暗，18s 完整性較好。利用紫外分光光在 1.8-2.0 之間，雜質(zhì)較少，表明

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 江幸福;張蕾;程云霞;羅禮智;;我國粘蟲研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報;2014年04期

2 姜玉英;李春廣;曾娟;劉杰;;我國粘蟲發(fā)生概況:60年回顧[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報;2014年04期

本文編號：2716687