【摘要】：本實驗起始菌株為實驗室已經(jīng)構(gòu)建的菌株13#菌株,該菌株中的GOD基因是使用了 DNA shuffling技術(shù)改造后的,其中有三個氨基酸序列發(fā)生了突變(D195G,T357A,L368P)。實驗過程中為提高菌株產(chǎn)酶的能力,分步進行了幾個階段的探索研究:第一階段:在破胞后對胞內(nèi)蛋白進行蛋白電泳發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)仍存在一部分目的蛋白未分泌出來,在蛋白表達分泌的角度對目的菌株進行了改造,分別在轉(zhuǎn)運,折疊,以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控對菌株進行了改造。在pGAPZB載體上插入了轉(zhuǎn)運因子SEC56,發(fā)酵結(jié)果顯示在表達了轉(zhuǎn)運因子后目的蛋白的表達量未得到提高;在pGAPZB分別插入了 CNE1,BDP和PDI三個折疊修飾因子,其中BIP基因的表達使得目的蛋白的表達量得到了提高;在pGAPZB載體上插入了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HAC1和THR,發(fā)酵結(jié)果在表達了HAC1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的菌株目的蛋白表達有提高。第二階段:對上罐發(fā)酵的鹽離子培養(yǎng)基的濃度進行了簡單的優(yōu)化,在BSM培養(yǎng)基離子濃度為0.5時顯示其菌體生長最好,酶活由364 U/ml提升到了 446 U/ml。在表達了 BIP基因后的菌株的3L鹽離子培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵最終測定粗發(fā)酵液的酶蛋白活性為530 U/ml,從粗發(fā)酵液的酶的活力來看酶的產(chǎn)量提高了 18%;同樣進行鹽離子培養(yǎng)基發(fā)酵的結(jié)果顯示表達了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HAC1的菌株最終發(fā)酵液酶活達到了 600 U/ml,酶的產(chǎn)量提升了 30%多;在之后的工作中對酶活最高的菌株HAC1進行了進一步的探究,在HAC1菌株中表達了來源于透明顫菌的血紅蛋白基因vgb,測定粗發(fā)酵液的活性結(jié)果酶蛋白的活性達到了 630 U/ml,該階段vgb蛋白的表達小弧度的提高了目的蛋白的表達,而該階段菌體的生長后期低于對照菌株。第三階段:對不同來源的基因的表達進行了對比,將突變后的黑曲霉來源的GOD和尼奇青霉來源的GOX進行密碼子優(yōu)化后進行了表達。發(fā)酵數(shù)據(jù)顯示同一基因來源的基因GOD,密碼子偏好性優(yōu)化之后進行的表達的菌株酶蛋白活性為540 U/ml,未進行密碼子偏好性優(yōu)化過進行的表達的菌株的酶蛋白活性為446 U/ml;不同來源的基因優(yōu)化過在同一表達體系中的表達量也純在差異,GOX的在菌株中最后的表達酶蛋白活性為640 U/ml,而GOD的酶蛋白活性為540 U/ml。經(jīng)鎳柱純化后經(jīng)過超微量分光光度計和蛋白電泳的驗證,結(jié)果顯示GOX來源的基因在最終蛋白表達量為1.32 g/L,GOD的量有1.17 g/L低于GOX的表達量。
【圖文】：

Ｍｅｔｈａｎｏｆ邋ｑｓ邐ｍＲＮＡ邋ＡＯＸ１逡逑圖１－２不同ＲＯＬ基因拷貝數(shù)對應(yīng)甲醇消耗的速率逡逑Ｆｉｇ，ｌ－２邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＲＯＬ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｐｙ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ｍｅｔｈａｎｏｌ邋ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ逡逑值得注意的是，盡管ＲＯＬ的ｍＲＮＡ達到ＲＯＬ四拷貝以上的水平，但隨著拷貝逡逑數(shù)從４增加到１５，目的蛋白的表達水平降低，因此也指出了邋ＲＯＬ基因在該表達系統(tǒng)逡逑中的限制條件，圖１－１為Ｅｌｅｎａ邋ＣＡｍａｒａｙａｎ研宄中轉(zhuǎn)錄量酶活和拷貝數(shù)之間的關(guān)系。逡逑Ｓ０００邋＝邐ｒ邋２逡逑�！蓿尬荩颍�0逡逑ＯＣ邐１Ｃ邐２Ｃ邐４Ｃ邐８Ｃ邐１５Ｃ逡逑＿＿邋￡ｘｔｒａｃｅ８ｕｌａｒ邋Ｈｐａｓｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ＭＨＨ邋ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｉｐａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邐ｍＲＮＡ邋ＲＯＬ邋—？—ｍＲＮＡ邋ＲＯｔ邋ｎｏｒｍａｌｓｊｅｄ逡逑圖１－３不同ＲＯＬ基因拷貝數(shù)基因轉(zhuǎn)錄效率逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＲＯＬ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｐｙ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｇｅｎｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ逡逑而很多文章顯示不同的基因在畢赤酵母中的最佳拷貝數(shù)依然還不是很清楚，在不逡逑同的基因的表達中有高拷貝顯示出了高目的蛋白的表達，而很多高拷貝的基因則表現(xiàn)逡逑出了更低量的表達。逡逑當(dāng)基因的拷貝數(shù)超過某個閾值時基因劑量增加經(jīng)常導(dǎo)致生產(chǎn)力降低和對細胞生逡逑長的嚴重負面影響

２．邋２構(gòu)建強轉(zhuǎn)運因子工程菌逡逑實驗的出發(fā)點：蛋白的表達過程需要經(jīng)歷在表達系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄，，翻譯，折疊修飾，逡逑轉(zhuǎn)運最后被分泌到細胞外，圖２－１為外源分泌蛋白的分泌路徑。逡逑泡融入逡逑Ａ邋芽泡邐＾邐質(zhì)膜逡逑0邋0逡逑心Ｊ■核焌邐ＶＪ＇Ｊ邐分泌出胞外逡逑高爾基體邐

本文編號：2701846