【摘要】：番紅花是鳶尾科番紅花屬球莖類草本植物,具有良好的活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效,現(xiàn)代多用于治療心腦血管疾病和抑郁癥。其特有的以藏紅花苦素、藏花醛、西紅花酸及其糖苷衍生物西紅花總苷為代表的類胡蘿卜素類化合物是發(fā)揮藥效的主要成分。番紅花柱頭是西紅花苷等成分合成和積累的場所,柱頭作為藥用部位其生物量較小而導(dǎo)致產(chǎn)量稀少。整合分析多重組學(xué)數(shù)據(jù),發(fā)掘西紅花柱頭發(fā)育或糖苷合成相關(guān)基因,利用分子生物學(xué)手段,開展番紅花有效成分生源途徑解析,并驗(yàn)證影響柱頭發(fā)育基因的生物學(xué)功能。在此基礎(chǔ)上,培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)番紅花品系,能有效緩解西紅花市場的供需矛盾。為了發(fā)現(xiàn)潛在的關(guān)鍵酶基因及分子調(diào)控基礎(chǔ),本課題針對不同發(fā)育時(shí)期的番紅花柱頭同步進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析,特別監(jiān)控與西紅花苷合成途徑相關(guān)的代謝流。從轉(zhuǎn)錄組中共組裝得到269,943條Unigenes,根據(jù)差異基因的表達(dá)趨勢可將所有的差異基因分為7種表達(dá)模式,共注釋出181條可能參與西紅花苷合成的酶基因,篩選出63個(gè)可能調(diào)控西紅花苷合成的轉(zhuǎn)錄因子。而代謝組分析指認(rèn)出15個(gè)西紅花苷合成途徑中的化合物,其含量變化趨勢可分為4種模式。為了深入挖掘基因和化合物間的相關(guān)性,本研究整合兩個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù),構(gòu)建了“轉(zhuǎn)錄因子-基因-化合物”共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),切實(shí)將候選基因的范圍縮小到32條酶基因及28條編碼轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄本。更重要的是,共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩分別篩選到7、4和4條目前在西紅花苷合成途徑中未被具體研究的關(guān)鍵酶基因β-GS、ADH和UGT。釀酒酵母的代謝工程研究顯示篩選的CsADH酶可催化合成西紅花酸,亦證實(shí)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選目標(biāo)基因方法的可靠性。綜合“基因-化合物”共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及熒光定量PCR結(jié)果,指認(rèn)AGL6b基因的表達(dá)與西紅花酸隨柱頭發(fā)育的含量變化正相關(guān)。而AGL6基因?qū)儆贛ADS-box調(diào)控因子家族,該家族在多種模式植物中都表現(xiàn)出調(diào)控花發(fā)育的功能,由此推測:番紅花AGL6b基因與西紅花苷合成途徑中的次生代謝產(chǎn)物積累有密切聯(lián)系,可能是通過調(diào)控番紅花花器官的發(fā)育,引起柱頭生物量的改變而導(dǎo)致次生代謝物含量變化。因而對來自西紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的17條MADS-box轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,解讀核苷酸序列,及對其編碼的氨基酸序列的組成成分、理化性質(zhì)、信號(hào)肽、導(dǎo)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、親疏水性、蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能域進(jìn)行預(yù)測分析,并將番紅花和其他植物的MADS-box蛋白進(jìn)行同源比對,同時(shí)構(gòu)建了番紅花和模式植物擬南芥MADS-box蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹,其結(jié)果為今后進(jìn)一步深入研究番紅花MADS-box蛋白的生物學(xué)功能提供可靠的參考依據(jù)。整合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及番紅花轉(zhuǎn)錄組,獲得5條在番紅花柱頭中特異性高表達(dá)的MADS-box基因,命名為SCR(Stigma and Crocins Regulator)。為了驗(yàn)證此類基因?qū)τ诜t花柱頭發(fā)育或糖苷合成的調(diào)控作用,對所得序列進(jìn)行克隆和分析,初步開展亞細(xì)胞定位及擬南芥過表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。CsSCR基因編碼的氨基酸分子量在25.0 kDa左右,等電點(diǎn)在9.15左右,均為堿性蛋白。同時(shí)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)蛋白都含有60個(gè)氨基酸組成的MADS結(jié)構(gòu)域,以及其后都接有93個(gè)氨基酸大小的K-BOX結(jié)構(gòu)域,證明5條蛋白都屬于MADS轉(zhuǎn)錄因子家族。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)5條番紅花SCR蛋白的轉(zhuǎn)錄因子特性,其定位于細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;而擬南芥過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CsSCR3和CsSCR5可調(diào)控?cái)M南芥花發(fā)育,導(dǎo)致早花現(xiàn)象出現(xiàn)。綜上所述,本研究整合多重組學(xué)數(shù)據(jù),報(bào)道了多個(gè)參與西紅花苷合成途徑的候選基因,為后續(xù)開展番紅花有效成分生源途徑解析奠定了基礎(chǔ),并提供了一個(gè)從柱頭發(fā)育角度提高西紅花苷含量的新型代謝工程研究視角。在此基礎(chǔ)上培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)番紅花品系,切實(shí)提升番紅花這一重要藥用資源的品質(zhì),為做強(qiáng)做大番紅花產(chǎn)業(yè)提供堅(jiān)實(shí)的上游支撐。
【圖文】：

組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建驗(yàn)材料和設(shè)備料紅花柱頭由上海華宇藥業(yè)有限公司西紅花 GAP 種植醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張漢明教授鑒定為鳶尾的柱頭。根據(jù)前人[33]對不同發(fā)育時(shí)期的番紅花柱頭分D 時(shí)期柱頭，細(xì)長花管中閉合花苞里約 0.8cm 長的紅兩天，細(xì)長花管中閉合花苞里約 3cm 長的暗紅色柱頭，細(xì)長花管頂生的張開花苞里約 3cm 長的暗紅色柱天，盛開花苞里約 3cm 長的暗紅色柱頭。每個(gè)番紅花同一球莖上 4 朵花的柱頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取 3 個(gè)后保存于-80℃超低溫冰箱。

- 16 -圖 1-2 qRT-PCR 程序設(shè)定圖數(shù)據(jù)處理：利用 2-ΔΔCt進(jìn)行相對定量，，根據(jù) Ct 法計(jì)算不同樣本中目的基因的表達(dá)水平。將 ΔCt 值最小的一組設(shè)為對照組，即基因表達(dá)量最高的樣品設(shè)為 1，使用相對定量公式進(jìn)行計(jì)算：目的基因的相對表達(dá)量即 2-ΔΔCt；ΔΔCt=(Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因)樣品-(Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因)對照；2-ΔΔCt表示與對照組相比，樣品組中目的基因表達(dá)量的變化倍數(shù)。（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1. 測序結(jié)果與質(zhì)量評估本實(shí)驗(yàn)使用IlluminaHiSeq2500平臺(tái)分別對三個(gè)發(fā)育時(shí)期（RED，-2DAY，0DAY）番紅花柱頭樣品（每個(gè)時(shí)期三個(gè)重復(fù)）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了 9 個(gè) cDNA 文庫。其中去除接頭和低質(zhì)量序列后，RED， -2DAY，0DAY 時(shí)期分別得到平均長度為 123.64,
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.239

【參考文獻(xiàn)】

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1 李卿;邸鵬;陸文銓;張磊;陳萬生;;丹參柯巴基焦磷酸合酶的生物信息學(xué)分析[J];中草藥;2015年06期

2 龍芳;李紹鵬;李茂富;;7種植物ALAD基因的生物信息學(xué)分析[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2013年06期

3 蔡娜娜;陳月輝;李偉;;基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測[J];計(jì)算機(jī)工程;2010年09期

4 李瀅;孫超;羅紅梅;李西文;牛云云;陳士林;;基于高通量測序454 GS FLX的丹參轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

5 張宏;張俊國;張伶;顏鈁;陳放;;西紅花有效成分合成研究進(jìn)展[J];化學(xué)研究與應(yīng)用;2009年06期

6 薛永常;聶會(huì)忠;劉長斌;;木質(zhì)素合成酶C3H基因的生物信息學(xué)分析[J];生物信息學(xué);2009年01期

7 陳靜,王靈臺(tái);西紅花治療慢性病毒性肝炎和肝炎后肝硬化的療效觀察[J];中成藥;1998年11期

8 李林，鐘德珍;中西醫(yī)結(jié)合脂肪肝臨床觀察附32例報(bào)告[J];北京中醫(yī);1995年06期

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本文編號(hào)：2691927