【摘要】：神農香菊(Chrysanthemum indicum var.aromaticum)是野菊(Chrysanthemum indicum)的一個新變種,全株主要化學成分為a-側柏酮、β-側柏酮、龍腦等萜類化合物,其花、葉、根均具有濃郁的香氣,是菊屬中罕見的芳香型觀賞花卉。萜類合酶(terpene synthase,TPS)是植物萜類代謝途徑中的一類關鍵酶,對植物體內的芳香物質起到重要的調控作用。本研究欲探究神農香菊單萜合酶基因(CiTPS)對植物中單萜物質的調控的作用,通過將CiTPS基因在煙草中過表達,初步探究CiTPS基因的調控功能,再對野菊進行遺傳轉化,以期更好挖掘神農香菊的芳香價值及改善野菊的芳香品質,同時也為今后培育色香型俱佳的菊花品種奠定理論基礎。本研究以神農香菊為實驗材料,在本實驗室前期神農香菊轉錄組數據的基礎上,克隆獲得CiTPS基因,對其進行生物信息學分析;構建過表達植物載體,轉化煙草,初步探究了 CiTPS基因的功能;優(yōu)化野菊的遺傳轉化體系,最終將CiTPS基因轉入野菊中。研究結果如下:1.克隆獲得的CiTPS基因開放閱讀框(OOF)長度為1818bp,編碼6005氨基酸;該基因具有單萜合酶的典型保守域和功能高度保守序列,即DDXXD、(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE和RRX8W,屬于單萜類合酶家族,具有合成單萜物質的功能;該基因所編碼的蛋白質相對分子量為70.1 1kDa,理論等電點(pI)為5.80,為不穩(wěn)定蛋白,親水性較強;多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析顯示,CiTPS基因序列與黃花蒿的反式芳樟醇OH1基因序列相似度可以達到91%,TPS基因屬于TSPb家族,其編碼的蛋白與黃花蒿和薊中TPS編碼的蛋白同源關系較近,。2.在已獲得神農香菊CiTPS基因的基礎上,雙酶切構建了pBI121-TPS-GFP植物過表達載體,通過電轉化法將pBI121-TPS-GFP重組質粒和pBI121-GFP空載體質粒導入農桿菌中,并利用農桿菌介導法成功轉入煙草植株體內。通過抗性生根篩選、抗性植株DNA和RNA的PCR檢測以及不同煙草株系的qRT-PCR檢測,證明成功獲得6株轉CiTPS基因和1株轉pBl1 21-GFP空載體的陽性煙草株系,并篩選出3株轉CiTPS基因煙草株系,分析其和野生型煙草、轉空載煙草T1代葉片在旺盛生長期的分泌物,初步探究出CiTPS基因具有提高植物體內單萜物質的功能。3.野菊葉盤在含1.0 mg/L 6-BA和0.8 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導效果最佳,其遺傳轉化的卡那霉素最適分化臨界耐受濃度為8 mg/L,最適生根臨界耐受濃度為10 mg/L,頭孢霉素抑菌濃度在篩選培養(yǎng)階段選用200 mg/L最佳。葉盤在經過預培養(yǎng)2 d,侵染10 min,共培養(yǎng)3 d后,遺傳轉化效率最高。利用農桿菌介導法將CiTPS基因和pBI121-GFP空載體轉入野菊,通過生根篩選、抗性植株DNA和RNA的PCR檢測,證明已成功過獲得3株轉CiTPS基因和2株轉pBI121-GFP空載體的陽性轉野菊株系。
【圖文】：

２．３結果與分析逡逑２．３．１總ＲＮＡ電泳及濃度檢測逡逑神農香菊葉片總ＲＮＡ邋（圖２－１）的５邋ｓ、１８邋ｓ和２８邋ｓ三條核糖體帶都清晰可見，說明逡逑所提神農香菊葉片ＲＮＡ的完整性好，質量較高并且無降解，可以進行下一步的實驗。逡逑瓜—■逡逑圖２－１神農香菊ＲＮＡ電泳圖逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｑｕａｎｔｉｔｙ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｔｏｔｏｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ邋ｉｎｄｉｃｕｍ邋ｖａｒ．邋ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ逡逑－１２－逡逑

邐２神農香菊７ＰＳ基因克隆及生物信息學分析邐逡逑２．３．２邋７７Ｗ基因克隆與序列分析逡逑以神農香菊幼苗葉片總ＲＮＡ經反轉錄獲得的ｃＤＮＡ為模板，利用ＰＣＲ擴增獲得目逡逑的片段（圖２－２）。用膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產物，將其與ｐＵＣ－Ｔ載體連接后轉化大腸逡逑桿菌ＤＨ５ｏｔ菌株感受態(tài)，利用ＰＣＲ擴增的方法篩選出１０個陽性克隆（圖２－３），選�。冲义蟼�條帶亮度好的克隆進行測序。結果顯示，基因序列具有完整的ＯＲＦ，其序列長度為逡逑１８１８ｂｐ，可以編碼６０５個氨基酸的多肽鏈（圖２－４），該序列具有單萜類合酶的典型保守逡逑域和功能高度保守序列，即ＤＤＸＸＤ、（Ｎ，Ｄ）邋Ｄ邋（Ｌ，Ｉ，，Ｖ）邋Ｘ邋（Ｓ，Ｔ）邋ＸＸＸＥ和逡逑ＲＲＸ８Ｗ，這表明所克隆的基因屬于單萜類合酶家族，將該基因序列命名為Ｃ／７７＾，并將逡逑序列在ＮＣＢＩ上進行登錄，登錄號為ＭＨ１２４７３７。逡逑．．—．逡逑
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S682.11

【參考文獻】

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本文編號：2679135