【摘要】：黑曲霉是工業(yè)生產中常用的絲狀真菌。本研究的研究對象黑曲霉SH2、HL_1具有不產孢子、蛋白分泌能力強等特點,并且可以進行高密度發(fā)酵在大規(guī)模發(fā)酵中應用廣泛。第三代基因組測序技術即單分子測序技術,沒有PCR擴增,杜絕了擴增引入堿基的錯誤,同時以其獨特的讀長特點,顯著減少后續(xù)的基因拼接以及提高功能注釋的質量,在基因組測序中具有顯著的優(yōu)勢。本研究應用第三代單分子測序技術,對黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1進行測序,通過組裝、功能基因注釋,分別將這兩菌株和黑曲霉CBS513.88進行比較基因組學研究,從基因和功能蛋白表達等方面闡述兩株菌的遺傳學特性。本研究的主要內容和結果如下。1.黑曲霉SH2、HL_1基因組組裝及功能基因注釋基于Pac Bio平臺,應用第三代單分子技術對黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1進行全基因組測序,獲得原始reads,用Celera、Falcon軟件分別進行組裝,獲得最優(yōu)結果,其中黑曲霉SH2獲得11個Scaffold,基因組大小為34.4Mb,基因11348個,外顯子35883個,蛋白質編碼區(qū)11348個,t RNA 317個,r RNA 57個,s RNA 62個,sn RNA 28個,mi RNA170個,GC含量49.74%。黑曲霉HL_1獲得28個contigs,基因組大小為34.6 Mb,基因10821個,外顯子35582個,蛋白質編碼區(qū)10821個,t RNA300個,s RNA4個,sn RNA18個,GC含量49.49%。2.黑曲霉菌株SH2、HL_1與模式菌株CBS513.88的比較基因組分析將黑曲霉SH2、HL_1的基因組序列與黑曲霉模式菌株CBS513.88進行核苷酸層次以及蛋白質層次的同源性分析,通過比對得出三菌株的基因組成差異以及兩菌株所缺失的基因,并通過PCR驗證生物信息學的分析結果,完善黑曲霉SH2和HL_1的基因組信息。其中,與黑曲霉菌株孢子發(fā)育相關的核心基因是An18g01170(Prp A),模式菌株CBS513.88存在該基因,將黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1與模式菌株進行全基因組比對,比對結果顯示黑曲霉SH2缺少該基因,而黑曲霉HL_1存在該基因,并且與CBS513.88是100%匹配,這與SH2菌株無孢子的表型以及HL_1產少量孢子的表型吻合。同時,兩菌株在蛋白質翻譯表達方面的基因富集較多,從理論上論證SH2和HL_1能夠成為工業(yè)生產中異源蛋白表達宿主的原因。系統(tǒng)進化分析結果顯示,SH2與ATCC-1015親緣關系較近,HL_1與CBS513.88親緣關系較近,該結果為明確工業(yè)黑曲霉菌株之間的親緣關系以及進化演變地位提供理論支持。3.對黑曲霉SH2、HL_1關鍵代謝基因的注釋與分析黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1是工業(yè)生產細菌,用于糖化酶生產以及異源表達宿主,對與蛋白翻譯轉錄以及分泌相關的基因簇聚類有重要工業(yè)價值,本研究主要對蛋白水解酶基因簇、多糖降解酶基因簇、轉錄因子基因簇、次級代謝基因簇以及與細胞壁相關基因簇進行聚類,并且構建了兩株黑曲霉的中心代謝網(wǎng)絡,這些信息對于利用基因修飾工術對菌株進行改造,從而進一步提高其蛋白分泌量有一定的參考價值。通過對兩株黑曲霉的密碼子使用頻率進行分析,獲得了兩株菌蛋白基因高表達高使用頻率密碼子ATG(甲硫氨酸,Met)、TGG(色氨酸,Trp),為工業(yè)菌株密碼子優(yōu)化及其改造提供參考。本論文旨在利用第三代單分子技術對兩株黑曲霉SH2和HL_1進行全基因組測序,并進行功能預測以及注釋,分析所有基因功能,充分了解兩株黑曲霉的遺傳特性、轉錄、以及表達等特點和機理,通過比較基因組學的研究,完善兩菌株的基因層面的信息,為現(xiàn)代化的工業(yè)生產提供遺傳信息支持,同時也為微生物基因組學的研究提供技術以及數(shù)據(jù)分析參考。構建了這兩株高產糖化酶黑曲霉的中心代謝途徑,并對其蛋白水解酶基因簇、多糖降解酶、次級代謝基因簇、與細胞壁相關基因簇聚類,這些基因簇與蛋白的表達或者分泌有一定的聯(lián)系,同時也對兩株菌的密碼子偏好性進行分析,這對于菌株改造、基因修飾或者密碼子優(yōu)化有一定的指導作用,對于進一步提高蛋白的產量有重要意義。
【圖文】：

圖 1-1 黑曲霉分生孢子梗的掃描電鏡圖[1]Fig. 1-1 Scanning electron microscope photo of Aspergillus niger conidial head[1]黑曲霉工業(yè)應用霉是重要的工業(yè)菌株，由于其獨特的生理特性以及強大且豐富的降解酶系適應多種培養(yǎng)環(huán)境，并且能快速生長發(fā)酵，及時在 pH 數(shù)值較低的環(huán)境中盛的代謝活性，同時不易受到雜菌污染，廣泛用于有機酸和生物制劑生產上常見的淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖酶、木聚糖酶[3]、單寧酶、植酸酶[4]等不同成分的培養(yǎng)基產生不同的酶制品組合。酶制品外，黑曲霉還應用于檸檬酸的生產中，而檸檬酸制藥、飲品等領域原料，目前全世界生產的檸檬酸中，超過 90%是由黑曲霉發(fā)酵獲得。另外食子等有機酸的生產菌株。霉在低 pH 中旺盛的代謝活性，可在廢水處理中用來降解有機物質，其胞

圖 2-4 生物信息學分析技術路線Fig. 2-4 Bioinformatics analysis technology route2.2 實驗方法2.2.1 黑曲霉 SH2 和 HL_1 的 DNA 提取及測序兩菌株 SH2 和 HL_1 基因組的提取主要參考 Raeder[47]等發(fā)表的方法,測序是應用PacBio 平臺，，主要的方法和步驟如下：1）首先收集 DPY 培養(yǎng)基中黑曲霉 SH2 和 HL_1 菌絲，去除培養(yǎng)基雜質2）分別轉移 SH2 和 HL_1 菌絲體至研缽內，液氮下均勻研磨，接著加入適量溶菌緩沖液3）分別加入等體積氯仿：苯酚：異戊醇（24:25:1）混合液后分別抽提 DNA 兩次4）分別吸取上清液（V:代表體積）加入到 2 倍體積無水乙醇（absolute ethyl alcohol）中，-20。C 沉淀 2 h
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳小斌;陳國慶;喬寵;;轉錄因子在滋養(yǎng)細胞浸潤行為調控中的作用[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2018年03期

2 烏日拉嘎;徐海燕;馮淑貞;孫志宏;孟和畢力格;張和平;;測序技術的研究進展及三代測序的應用[J];中國乳品工業(yè);2016年04期

3 隋雨菲;歐陽立明;魯洪中;莊英萍;張嗣良;;黑曲霉組學研究進展[J];生物工程學報;2016年08期

4 田李;張穎;趙云峰;;新一代測序技術的發(fā)展和應用[J];生物技術通報;2015年11期

5 劉新育;王一凡;王明道;陳紅歌;;熱擊對黑曲霉孢子萌發(fā)及產木聚糖酶的影響[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2013年11期

6 李亦學;李軒;;新一代測序技術的發(fā)展和應用[J];中國科技投資;2012年07期

7 李文;王陶;李同祥;;氯化鋰誘變黑曲霉原生質體選育高產植酸酶菌株[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2012年02期

8 楊曉玲;施蘇華;唐恬;;新一代測序技術的發(fā)展及應用前景[J];生物技術通報;2010年10期

9 郭艷梅;鄭平;孫際賓;;黑曲霉作為細胞工廠:知識準備與技術基礎[J];生物工程學報;2010年10期

10 彭翼飛;馬文麗;;寡核苷酸陣列比較基因組雜交技術及其應用[J];中國生物工程雜志;2006年10期

相關會議論文 前1條

1 李達

本文編號：2678110