【摘要】：背景:肺癌是世界范圍內發(fā)病率和死亡率均較高的惡性疾病之一,而非小細胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)是其最常見的類型,約占所有肺癌病例的80%。肺癌常規(guī)的治療方法包括外科治療、放射治療、化學治療,隨著分子生物學的迅猛發(fā)展,靶向治療正在逐步成為肺癌的主要治療手段之一。因此,尋找NSCLC發(fā)病過程中的關鍵基因和相關信號通路,并揭示其中的分子機制,對于NSCLC靶向治療至關重要。研究者們先已發(fā)現(xiàn)了許多在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中起決定作用的癌基因和癌相關蛋白,為治療提供了新的研究和治療思路。水通道蛋白5(Aquaporin 5,AQP5)一種跨細胞膜的水通道蛋白,具有調節(jié)細胞內水平衡的作用。近期有研究表明,AQP5在多種腫瘤細胞中表達上調,可促進惡性腫瘤細胞的增殖,對其進行基因沉默可抑制腫瘤生長。但AQP5與NSCLC之間的相關性仍有待探索。目的:在國內外研究的基礎上,通過基因工程重組技術沉默AQP5基因在NSCLC細胞中的表達,系統(tǒng)評價AQP5對NSCLC細胞增殖凋亡、遷徙侵襲等生物學功能的影響,并進一步探討AQP5基因沉默后對相關功能蛋白的及信號轉導通路的影響,闡述AQP5與NSCLC發(fā)生發(fā)展的密切關系及相關的信號轉導通路及分子機制,為NSCLC的治療提供新靶點。方法:1.Western Blot方法檢測正常人肺細胞MRC-5和人肺癌細胞系HCC827、A549、H1299、H358中AQP5的表達水平,篩選出AQP5高表達細胞系A549。設計并構建特異性真核表達質粒AQP5-p GCH1/Neo和陰性質粒NC-p GCH1/Neo,利用脂質體轉染入A549細胞,構建AQP5基因沉默細胞及陰性對照組細胞。Real-time PCR和Western Blot方法檢測并比較未處理細胞組、陰性對照組及基因沉默組細胞的AQP5基因和蛋白表達水平。2.利用細胞集落形成實驗,MTT法檢測各組細胞增殖活力,采用流式細胞術考察細胞周期分布及細胞凋亡差異;Western Blot法檢測細胞凋亡通路相關蛋白Bcl-2、Cleaved caspased-3和Bax的表達情況。3.劃痕實驗觀察三組細胞的遷移能力,Transwell侵襲實驗觀察侵襲能力,Western Blot法檢測腫瘤轉移相關蛋白MMP-2,MMP-9和Vimentin表達水平。4.利用Western Blot對ERK1/2信號通路相關蛋白p-ERK、p-CREB和c-fos表達量進行檢測,探討AQP5對ERK1/2信號通路的影響。5.在上述體外實驗的基礎上,將未處理細胞組、陰性對照組及基因沉默組三組細胞接種于裸鼠皮下,建立體內異種移植瘤模型,觀察體內情況下AQP5表達下調對腫瘤細胞的增殖和凋亡影響。結果:1.成功構建含有AQP5 sh RNA的AQP5-p GCH1/Neo質粒和陰性對照質粒NC-p GCH1/Neo,并轉染至A549細胞;轉染AQP5-p GCH1/Neo質粒的A549細胞中AQP5基因和蛋白表達水平均顯著降低。2.細胞集落實驗表明,AQP5 sh RNA組形成細胞集落能力顯著下降;MTT實驗表明AQP5 sh RNA細胞組各時間點吸光度均降低,時間越長,差異越顯著。流式細胞儀結果表明AQP5 sh RNA組細胞阻滯在G0/G1期,而在S期、G2/M期細胞數(shù)量顯著減低,并且凋亡顯著。凋亡相關蛋白檢測結果顯示AQP5 sh RNA組Bcl-2表達下調,Cleaved caspased-3和Bax表達上調,Bcl-2/Bax比值降低,說明AQP5基因沉默抑制腫瘤細胞增殖,阻滯細胞周期,抑制腫瘤細胞分裂,并可通過調控Bcl-2家族凋亡相關蛋白促進A549細胞凋亡。3.細胞遷移實驗結果顯示AQP5 sh RNA組細胞遷移能力下降。Transwell細胞侵襲實驗表明AQP5 sh RNA組進入下層小室細胞減少,侵襲能力下降。Western Blot結果顯示腫瘤轉移關鍵因子MMP-2和MMP-9和間質細胞轉化標志蛋白Vimentin表達降低,說明AQP5表達下調降低腫瘤細胞侵襲能力,抑制腫瘤細轉移。4.AQP5 sh RNA組細胞p-ERK、p-CREB和c-fos表達量均顯著降低。說明AQP5表達下調可降低ERK1/2信號通路蛋白磷酸化,抑制ERK1/2信號通路。5.AQP5 sh RNA組小鼠的腫瘤體積、重量顯著小于對照組,腫瘤生長速度明顯下降;Tunel法檢測腫瘤凋亡結果顯示AQP5 sh RNA組小鼠腫瘤組織中凋亡細胞更多。說明在體內環(huán)境下,AQP5基因沉默可抑制腫瘤增殖,促進腫瘤凋亡。結論:1.使用RNAi技術建立了非小細胞肺癌A549細胞的AQP5基因沉默細胞系。2.證實AQP5與非小細胞肺癌A549生物學功能關系密切,表達下調抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲,促進腫瘤細胞凋亡,并能調控相關功能蛋白的表達水平,對ERK1/2信號通路有抑制作用。3.為非小細胞肺癌的診斷和治療提供新的潛在標志物及靶點。4.為RNA干擾技術治療腫瘤疾病提供實驗研究數(shù)據。
【圖文】：

圖 1 AQP5 結構示意圖[94]顯示 AQP5 的基本單體Fig1 structure diagram display the basic monomer of AQP52.2 AQP5 的調控機制尚未完全了解 AQP5 蛋白表達調控的分子機制。然而，已知 AQP5 基因的啟

圖 1.1 pGCsi-H1/Neo/GFP 質粒圖譜ure 1.1 Plasmid Profile of pGCsi-H1/Neo析比對，表明插入序列與設計序列完全粒。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：2678064