【摘要】：背景急性胰腺炎(AP)是常見的急性腹部炎性疾病,主要表現為腺泡細胞損傷、氧化應激和胰腺炎癥,經常由膽結石疾病或過量飲酒引起,目前仍有較高的發(fā)病率和死亡率。大部分急性胰腺炎患者的預后良好,可以完全治愈,但仍有大約20%的患者會有發(fā)生器官衰竭的風險,急性胰腺炎患者是否有臟器功能衰竭以及持續(xù)時間決定了早期病情的嚴重程度。2012年美國亞特蘭大會議將急性胰腺炎分為輕癥、中度重癥和重癥急性胰腺炎3種。輕癥急性胰腺炎患者不合并臟器功能障礙,病死率幾乎為零;中度重癥急性胰腺炎患者往往伴有一過性器官功能衰竭(持續(xù)時間不超過48小時),病死率介于輕癥急性胰腺炎與重癥胰腺炎之間。病程當中一旦出現持續(xù)性臟器功能障礙,很容易將患者劃分為輕度或重度胰腺炎,但對改善預后沒有幫助,只有在疾病的早期就能夠很好的預測急性胰腺炎疾病發(fā)展的進程和結果,才能盡早的制定有效的治療方案以及采取干預措施,避免發(fā)生多臟器功能衰竭,從而改善預后。盡管許多單個生物預后標志物和多個評分系統己經被試用,但目前仍然沒有一個被廣泛接受的。因此,迫切需要尋找新的診斷和治療靶點來改善急性胰腺炎尤其是重癥患者的生存率。RNA干擾技術(RNAi)是最近幾年來新產生的一種在基因功能研究和基因治療上具有廣闊的應用前景的生物技術,因為它的實施簡單有效,并且研究表明應用微量的siRNA即可達到使其編碼的致病基因產物的含量下降90%以上的目的,有的甚至可以達到完全基因敲除的效果,所以逐漸成為了代替基因敲除的有力工具。慢病毒載體是一種基因治療載體,具有極好的包裝能力,可以在不同哺乳動物細胞中維持長期穩(wěn)定的轉基因的表達,并且不出現病理損害現象。慢病毒載體具有廣泛的細胞趨性,無論對分裂細胞還是非分裂細胞均具有感染能力,可以容納片段比較大的外源性基因,是目前常用的RNA干擾技術,它的發(fā)展形成了一個可以應用于減少目標基因的表達系統。雙特異性磷酸酶-1(DUSP1)又被稱為絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP1),屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸酶家族中的一員,其表達受許多細胞外刺激物誘導,包括生長因子、細胞因子和應激等,對MAPK具有強有力的負監(jiān)管作用,DUSP1基因被認為是腫瘤抑制因子和癌癥相關炎癥的調節(jié)器,更重要的是DUSP1在抗炎方面也發(fā)揮著重要的作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是所謂的進化守恒的絲氨酸和蘇氨酸蛋白酶,它參與到連接細胞表面受體和主要調節(jié)細胞核和細胞內靶體的信號轉導通路中。MAPKs被視為急性胰腺炎發(fā)展的早期階段的主要信號傳導器,在哺乳動物中,有多種MAPK酶負責細胞增殖、凋亡、分化和存活。MAPK磷酸酶(包括DUSP1)可以通過MAPK脫磷酸化或干擾作用于MAPK的效應分子結合,從而抑制信號通路的轉導和細胞因子激活。急性胰腺炎病情加重甚至惡化的關鍵是在急性胰腺炎期間失去對多種炎癥介質的控制,從而引發(fā)級聯反應,導致胰腺組織的大量壞死,并因系統性多器官衰竭而變得更為復雜。就這一點而言,細胞因子的作用一直是關注的焦點。本研究旨在通過慢病毒載體沉默DUSP1從而增強MAPK信號通路的作用,PD98059作為MAPK信號通路的抑制劑抑制MAPK信號通路,觀察急性胰腺炎小鼠模型血清及組織中促炎因子的表達以及MAPK通路相關基因蛋白表達情況,探索其對促炎因子釋放的調控機制及對多臟器損傷的影響。目的通過慢病毒載體沉默DUSP1基因,觀察急性胰腺炎小鼠模型血清及組織中促炎因子的表達以及MAPK通路相關基因蛋白表達情況,探索慢病毒載體沉默DUSP1基因通過MPK通路介導急性胰腺炎小鼠促炎因子釋放的調控機制以及對多臟器損傷的影響。方法1.表達siRNADUSP1載體的構建:設計2條siRNA和一條陰性對照序列siRNA1、5'-TAGCGTCAAGACATTTGCTGA-3',siRNA2、5'-CTGTACTATCCTGTAAATATA-3',scramble siRNA、5'-GGCAAGCTGACCCTGAAGTTC-3'檢測DUSP1的表達情況,篩選沉默效率高的siRNA。2慢病毒包裝及滴度測定選擇沉默效率高的siRNA,采用脂質體法,分別與慢病毒包裝質�；旌衔锕厕D染293T細胞,并進行病毒滴度測定。3小鼠急性壞死性胰腺炎模型制備及分組選取105只清潔級健康雄性KM小鼠,制模小鼠在實驗前禁食12h,自由飲水。小鼠按4g/kg體質量予腹腔內注射20%L-精氨酸,分兩次腹腔內注射,每次注射間隔1h,制備小鼠急性胰腺炎模型。按隨機數字表法將小鼠分為7組,每組15只:(1)control組:健康小鼠,注射相同劑量的生理鹽水。(2)siRNA組:健康小鼠,腹腔注射0.88mg/kgDUSP1-siRNA慢病毒。(3)AP組:模型小鼠。(4)AP+PD98059組:在AP誘導前0.5h與誘導后1h腹腔注射PD98059 10mg/kg,其余各組采用相同劑量的生理鹽水代替PD98059。(5)AP+siRNA組:小鼠造模成功后,予以腹腔注射0.88mg/kgDUSP1-siRNA慢病毒。(6)AP+scramble組:小鼠造模成功后,予以腹腔注射0.88mg/kg scramble-siRNA慢病毒。(7)AP+PD98059+siRNA組:在AP誘導前0.5h與誘導后1h腹腔注射PD9805910mg/kg,造模成功后,予以腹腔注射0.88mg/kgDUSP1-siRNA慢病毒。各組小鼠分別在制模后相應時間點即12小時、24小時、48小時經全麻心臟取血(作為血液標本),于建模48小時后處死小鼠,立即取得胰腺組織、肝臟組織、肺臟組織和腎臟組織。4 Elisa法檢測血清中促炎因子及HMGB1和S100A12含量于建模后12小時、24小時、48小時,分別選取各組5只小鼠行心臟取血,嚴格按照試劑盒要求采用Elisa方法檢測各組小鼠血清中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)以及 HMGB1 和 S100A12 含量。5測定急性胰腺炎小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平各組小鼠建模后12小時、24小時、48小時測定血清中淀粉酶、脂肪酶水平,各指標的檢測嚴格按照試劑包的要求進行操作。6 HE染色將小鼠的胰腺、肝臟、腎臟和肺組織用4%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE法進行染色,用光學顯微鏡觀察各臟器組織病理學改變,并采取照片。7 RT-qPCR根據病毒核酸提取的說明書,通過試劑盒一步法提取組織標本中的總RNA,并且測定總RNA的質量和濃度。采用兩步法進行提取RNA的逆轉錄。采用TaqMan探針法進行RT-qPCR檢測,檢測各臟器組織中促炎因子(TNF-α、IL-1β和 IL-6)、DUSP1、HMGB1 和 S100A12 的 mRNA 表達量。8 Western提取各組胰腺、肝臟、腎臟和肺組織樣本,清除血液和其他組織,用超聲波粉碎。采用蛋白免疫印跡法檢測各組織中DUSP1及MAPK通路相關基因蛋白的表達量。結果1.設計的siRNA2序列具有較高的沉默效率,采用pSIH-DUSP1-siRNA2包裝的慢病毒對293T細胞的感染率超過90%。2.與對照組相比,siRNA組中血清淀粉酶、脂肪酶水平以及血清和組織中的促炎因子、HMGB1和S100A12都有升高,但都無顯著差異;而在其他5組中各項指標的表達顯著增加。3.與AP組相比,AP + siRNA組組織中DUSP1表達下降,而血清中各項指標的表達明顯升高,并且組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1 和 S100A12mRNA的表達以及MAPK信號通路中相關基因蛋白p-ERK、p-JNK和p-p38的表達也明顯升高,胰腺組織的病理改變加重;AP + PD98059組血清中各項指標的表達下降,并且組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1 和 S100A12mRNA的表達以及MAPK信號通路中相關基因蛋白p-ERK、p-JNK和p-p38的表達也下降,而胰腺組織的水腫程度減輕;AP+scramble組和AP+PD98059+siRNA組無顯著性差異。4.在各組急性胰腺炎小鼠模型中,血清中HMGB1和S100A12的表達水平與TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平呈正相關。5.與AP組相比,AP + siRNA組胰腺、肝臟、腎臟和肺組織的病理改變明顯加重,而AP + PD98059組胰腺、肝臟、腎臟和肺組織的病理改變減輕。結論1.采用pSIH-DUSP1-siRNA2包裝的慢病毒可以有效的抑制細胞中DUSP1的表達。2.在急性胰腺炎小鼠模型中DUSP1基因沉默可以促進促炎因子的釋放,其作用機制可能是通過對MAPK信號通路中的ERK、JNK和p38的磷酸化而發(fā)揮其活性作用,增強了 MAPK信號通路的作用,從而促進促炎細胞因子釋放。3.血清中HMGB1和S100A12的表達水平與TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平呈正相關,提示作為MAPK信號通路的上游因子的HMGB1和S100A12與TNF-α、IL-1β和IL-6之間存在正反饋關系,共同促進炎癥進程的發(fā)展。4.TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1和S100A12的過度表達可以加重急性胰腺炎小鼠模型胰腺、肝臟、腎臟和肺組織的病理改變,從而更容易發(fā)生多臟器功能衰竭,加重急性胰腺炎的病情。5.早期檢測DUSP1的表達水平,可以提前預測發(fā)生多臟器功能衰竭的幾率,通過對DUSP1和MAPK信號通路的調節(jié)可以改變急性胰腺炎小鼠各臟器損傷的程度,為治療提供新的靶點。
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邐山東大學博士學位論文邐逡逑以后各孔熒光消失，而此孔陽性細胞小于５個，則將該孔作為計量孔，計為１邋ＩＵ。逡逑計量陽性細胞數為ｍ，用來計算病毒的滴度。計算公式為病毒滴度＝ｍｘ（ｌＩＵｘ計逡逑量孔相對于第１孔的稀釋倍數）／第１孔加入的病毒體積。逡逑３．結果逡逑３．１ｓｉＲＮＡ２沉默效率較高逡逑蛋白免疫印跡結果顯示（圖１），與空白組比較ＮＣ組ＤＵＳＰ１表達差異無逡逑統計學意義（Ｐ＞0．0５）。相比空白組，ｓｉＲＮＡＩ組ＤＵＳＰ１表達下降３５．５６％，逡逑ｓｉＲＮＡ２組下降５４．７２％，說明ｓｉＲＮＡ２的沉默效率較高。因此，，采用逡逑ｐＳＩＨ－ＤＵＳＰ１－ｓｉＲＮＡ２與慢病毒包裝。逡逑Ａ逡逑

ｐＳＩＨ－ＤＵＳＰ１－ｓｉＲＮＡ２與慢病毒包裝。逡逑Ａ逡逑Ｂｌａｎｋ邋ＮＣ邋ｓｉＲＮＡＩ邋ｓｉＲＮＡ２邐５邋０邐？逡逑ＤＵＳＰ１邐＿邋丨＿邋丨丨邋＿邋丨＿．？丨邋ｓｏ－逡逑ｉ４。■邋■邋＿逡逑｜３－ａｃｔｉｎ邐＾邋２0＇逡逑１邋0ｉＶ－Ｖ—＾＿圖１由蛋白免疫印跡法檢測的各轉染組的ＤＵＳＰ１表達逡逑注：＊，與空白組和陰性對照組比較，尸＜０．０５；逡逑＃，與ｓｉＲＮＡＩ組比較，Ｚ５邋＜邋０．０５．逡逑３．２慢病毒滴度的測定和２９３Ｔ細胞感染結果逡逑病k斜懷曬Φ陌埃∈禿舐《炯械男Ъ凼牽擔叮玻

本文編號：2672255