【摘要】：DCE-01是一株“廣譜性”、“高效性”脫膠菌,對多種草本纖維原料均能起到很好的脫膠作用,且6.0 h能獨立完成苧麻脫膠,不需要其他化學(xué)方法后處理補充。其脫膠功能的廣譜性和高效性在國內(nèi)外都屬于領(lǐng)先地位。本文以DCE-01菌株為研究對象,從DCE-01菌株中克隆出3個關(guān)鍵脫膠酶基因,以2種不同的排列方式將這3個關(guān)鍵脫膠酶基因串聯(lián)起來,分別在大腸桿菌和DCE-01菌株中表達,獲得結(jié)果如下:1.根據(jù)全基因組測序注釋結(jié)果設(shè)計特異引物,從DCE-01菌株克隆出關(guān)鍵脫膠酶基因片段3個:果膠酶基因(pelE)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man)。經(jīng)測序及生物信息學(xué)分析:pelE核酸序列長1185 bp,編碼395個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為43.8 kDa;xyn核酸序列長1251 bp,編碼416個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量45.74 kDa;man核酸序列長1137 bp,編碼378個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量41.85 kDa。2.通過設(shè)計特異引物和PCR擴增獲得帶有特定限制性酶切位點的關(guān)鍵脫膠酶基因(PelE基因、Xyn基因和Man基因)片段,經(jīng)酶切并與表達載體pET-28a連接,構(gòu)建成單基因表達重組子,同時,按照PXM、XPM的順序串聯(lián)排列在表達載體pET-28a的MCS區(qū)段上,構(gòu)建成多基因共表達重組子,然后,將單基因表達重組子和多基因共表達重組子導(dǎo)入BL21菌株中,成功構(gòu)建PelE、Man和Xyn的單基因表達重組菌株(pET-28a-P/BL21、p ET-28a-M/BL21和pET-28a-X/BL21)和多基因共表達重組菌株(pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21)。3.將構(gòu)建的重組子轉(zhuǎn)入到DCE-01(關(guān)鍵脫膠酶基因來源菌株)中,成功獲得單基因同源表達的重組菌株3個,包括pET-28a-P/DCE-01、pET-28a-X/DCE-01、pET-28a-M/DCE-01,多基因同源共表達的重組菌株2個,即pET-28a-PXM/DCE-01(或DCE01~(PXM))和pET-28a-XPM/DCE-01(或DCE01~(XPM))。4.對BL21系列重組菌株的酶活測定結(jié)果顯示:(1)pelE重組菌株所表達PelE酶活為471.97U/mL,而把pelE排列在啟動子后面第一位和第二位所形成pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21時,對應(yīng)的PelE酶活分別是532.68 U/mL和121.43 U/mL。(2)xyn重組菌株所表達Xyn酶活為44.32 U/mL,而把xyn排列在啟動子后面第一位和第二位所形成pET-28a-XPM/BL21和pET-28a-PXM/BL21時,對應(yīng)的Xyn酶活分別是47.43 U/mL和31.42 U/mL。(3)man重組菌株所表達Man達16882.86 U/mL,而將man排在遠離啟動子位置形成的pET-28a-PXM/BL21與pET-28a-XPM/BL21時,對應(yīng)的Man酶活分別為645.21 U/mL和230.83U/mL。因此,可以推論:(1)用于構(gòu)建多基因共表達體系的載體的啟動子對pel E的表達效果有顯著促進作用;(2)構(gòu)建多基因共表達體系時,目的基因的表達效果與插入位點離啟動子的距離呈負(fù)相關(guān),即距離越遠效果越差;(3)在多基因共表達體系中,man的表達效果受pelE插入位點的影響突出。5.以DCE-01和DSM18020(模式菌株)為對照,對多基因同源共表達重組菌株純培養(yǎng)液的酶活測定結(jié)果顯示:(1)重組菌株DCE01~(PXM)、DCE01~(XPM)的PelE酶活性分別是DCE-01菌株的2.77倍、1.01倍和DSM18020菌株的10.91倍、4.11倍;(2)重組菌株DCE-01~(PXM)、DCE-01~(XPM)的Xyn酶活性分別是DCE-01菌株的1.28倍、1.82倍和DSM18020菌株的5.61倍、8.08倍;(3)重組菌株DCE-01~(PXM)、DCE-01~(XPM)的Man酶活性分別是DCE-01菌株的1.99倍、1.01倍和DSM18020菌株的6.16倍、3.16倍。由此可以得出結(jié)論:采用基因串聯(lián)方法將來自DCE-01菌株的關(guān)鍵脫膠酶基因(pelE、xyn、man)整合到表達載體(pET-28a)中形成重組子,無論是導(dǎo)入原核表達菌株E.coli BL21(DE3)還是導(dǎo)入DCE-01菌株都獲得了成功表達,而且多基因同源共表達重組菌株表達PelE、Xyn、Man的酶活都高于DCE-01菌株。6.液相色譜分析DCE-01、DSM18020、DCE-01~(PXM)、DCE-01~(XPM)菌株用于苧麻脫膠發(fā)酵液的結(jié)果表明:DCE-01~(PXM)菌株的發(fā)酵液中檢測到的單糖含量要明顯高于其他幾個菌株,DCE-01~(PXM)菌株發(fā)酵液中的單糖含量略高于DCE-01菌株,而DCE-01菌株脫膠發(fā)酵液的單糖含量要明顯高于DSM18020菌株。這一結(jié)果與上述酶活檢測結(jié)果基本一致,說明將DCE-01關(guān)鍵脫膠酶基因按照PXM的順序串聯(lián)排列形成重組子后導(dǎo)入DCE-01中進行多基因同源共表達的方法,能在一定程度上提升DCE-01的脫膠功能。
【圖文】：

基因因組 DNA 當(dāng)作模板，用設(shè)計的聚糖酶基因（man）的 PCR 擴增。了明亮、單一的目的條帶，在 120elE 片段為 1185 bp、xyn 片段為 1。圖 2.1 DCE-01 菌株基因組 DNAFig. 2.1 Genomic DNA of the strain DCD: DCE-01 基因組 DNA; M: DNA m

用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖2.2）可以看出，擴增出了明亮、單一的目的條帶，在 1200 bp 附近，基因片段大小基本與預(yù)測結(jié)果一致。經(jīng)測序分析：pelE 片段為 1185 bp、xyn 片段為 1251 bp、man 片段為 1137 bp。初步說明，關(guān)鍵酶基因擴增取得成功。2.3.3 篩選與鑒定重組子將PCR擴增得到的目的基因片段進行加 A尾，再與pMD 19-T進行TA連接，導(dǎo)入E.coli Top10受體，，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒 pMD 19-T-P、pMD 19-T-X 和 pMD 19-T-M。對陽性克隆進行菌落 PCR，圖 3 結(jié)果表明：1200 bp 附近出現(xiàn)單一清晰的條帶
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;Q936

【參考文獻】

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本文編號：2672172