【摘要】：三角帆蚌是我國重要的淡水珍珠蚌,有相關研究表明雄性三角帆蚌的產(chǎn)珠性能相較雌性具有優(yōu)勢,三角帆蚌、雙殼綱乃至整個軟體動物門的性別形成機制都缺乏系統(tǒng)性的探究,作為較為低等的動物,性別表現(xiàn)形式的多樣性往往是性染色體上或胞質(zhì)性別相關基因和環(huán)境因素共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。在高等脊椎動物性別決定和分化中存在一些已被證實的信號通路基因,本實驗選取了其中三個較為經(jīng)典的Transformer-2α,β-catenin和SOX2基因,對三角帆蚌這3個基因的序列、結(jié)構(gòu)、雌雄各組織表達、早期發(fā)育時期的表達以及細胞定位進行研究,初步探討這些基因在三角帆蚌性別決定和性別分化的功能。另外在前期工作基礎上,對M型COII基因3’端特有序列的功能進行初步研究,探討其在性別分化中的作用。1.三角帆蚌Transformer-2α基因的克隆與表達分析克隆得到了三角帆蚌的Transformer-2α的cDNA序列全長,為1867bp,其中包括92bp的5’非翻譯區(qū)和881bp的3’非翻譯區(qū),開放閱讀框為894bp,編碼297個氨基酸。預測其蛋白相對分子量為34661.2,理論等電點為11.02,不具備信號肽也不具備跨膜結(jié)構(gòu),具有RNA識別基序(RRM)和一個絲氨酸/精氨酸富集區(qū)域(SR)。熒光定量結(jié)果顯示Transformer-2α基因在雄性各組織的表達均高于所對應的雌性組織,推測Transformer-2α基因在雌雄中存在不一樣的剪切體進而導致性別朝不同方向分化。時期表達發(fā)現(xiàn)胚胎期3天左右存在一個表達峰值說明可能在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。原位雜交結(jié)果顯示雌雄性腺中都存在信號,說明了該基因的雙向剪切功能。2.三角帆蚌β-catenin基因的克隆與表達分析克隆得到了三角帆蚌β-連環(huán)蛋白(β-catenin)基因的cDNA序列,全長為5544bp,開放閱讀框2463bp,編碼氨基酸820個,5’非翻譯區(qū)1355bp,3’非翻譯區(qū)1726bp,沒有信號肽也沒有跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白結(jié)構(gòu)域中央為12個犰狳重復結(jié)構(gòu)域(ARM),該結(jié)構(gòu)域在物種間保守度極高。雌雄各組織的熒光定量結(jié)果顯示除外套膜外,雌性各組織的表達量都顯著高于雄性(P0.01),β-catenin基因本身就是親卵巢的基因,說明其在雌性性腺發(fā)育過程中的重要性。時期定量在胚胎期第3天出現(xiàn)了峰值,推測參與了胚胎發(fā)育過程。原位雜交信號在雌性中較雄性較強,總而言之,β-catenin基因在雌性性別形成中發(fā)揮舉足輕重的作用,而在雄性中并不是必需的。3.三角帆蚌SOX2基因的克隆與表達分析克隆了三角帆蚌的SOX2基因的cDNA序列,序列全長為1840bp,5’UTR為163bp,3’UTR為1005bp,開放閱讀框為672bp,氨基酸223個。3’端存在AATAAA盒子和PolyA尾,3’UTR內(nèi)存在9個ATTTA單元。分子量為25136.15u,理論等電點為10.19,平均親水系數(shù)為-1.243,谷氨酰胺在氨基酸組成中所占比例最高,為10.3%,無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。氨基酸序列包含由72個氨基酸組成的HMG-box和由48個氨基酸組成的SOXp結(jié)構(gòu)域,因此可以斷定屬于SOX家族基因。熒光定量結(jié)果顯示雌雄都在斧足中表達量最高,肝臟中基本不表達,雌性性腺表達量顯著高于雌性,說明了SOX2基因的多功能性。時期表達也顯示在3天左右最高,也參與到了胚胎的發(fā)育過程。原位雜交結(jié)果顯示雌性信號更強。4.M型COII基因的Western blot實驗分析本課題組研究工作表明三角帆蚌線粒體基因序列中存在M型和F型COII基因2種不同序列,其中M型COII基因3’末端比F型多出546bp的序列,利用這一多余且猜測可能存在功能性的序列設計特異性抗體檢測雌雄各組織表達,發(fā)現(xiàn)只存在雄性性腺,其余組織和雌性中基本沒有,蛋白層面上證明該基因在雄性中特異性表達。
【圖文】：

gacatatgacaaaaatgtttggaagcttgtaatcctacactttttgttcagcaatgtgctgcctcccagatgtaatgatttaacactaatatttaaaaggctttcttcaaattttagagttaagaacttgaactctttattatgactttaatttctaaaatcagaataaaacttggaaagagtttggttcttccatgtggactttgaattaacaacagtcagctgtaacagtagtatggactcatgttttcaggaagttttctttcagcctccagttcagttcagaatgtagcccaataaattgttttgtctgaaaataaaatgttacgctaaaaaaaaaaansformer-2α 基因的核苷酸和氨基酸序列，小寫字編碼區(qū)，上面字母為核苷酸序列，下面字母為氨尾信號由下劃線標出，RRM 結(jié)構(gòu)域序列由陰影部and deduced amino acid sequence of Transformer-2’,5’ untranslated regions; Uppercases was coding es sequence and the lower showed the amino acids; ion signals(AATAA) were underlined; The shado

圖 2-4 不同物種 Transformer-2α 基因氨基酸序列構(gòu)建的 NJ 系統(tǒng)進化樹。注：MEGA5.0 軟件的 NJ 法，節(jié)點上的數(shù)字表示重復 1000 次的自舉（Bootstrap）Figure2-4 NJ phylogenetic tree of amino acid sequences of Transformer-2α gene speciesNote: NJ law contribution was made by MEGA5.0, the number on the node were bconfidence value repeated 1000 times.2.3 Transformer-2α 基因的組織表達在熒光定量檢測雌雄各組織表達量后發(fā)現(xiàn)，，Transformer-2α 基因在組織中均有表達，雌性組織和雄性組織中都是肝臟表達量最高，雌性外量最低，雄性斧足表達量最低。雌雄性腺中表達量都居于第二名，僅此同時利用 SPSS 單因素方差分析顯示肝臟中雌雄間存在顯著性差異，閉間則存在極顯著性差異�？傮w看來，Transformer-2α 基因在雄性各組織
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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