【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是我國乃至全世界重要的糧食作物,其產量的高低一直成為人們關注的熱點問題之一。近年來,非生物脅迫日趨嚴重,嚴重影響植物的生長和產量。尋找、篩選和鑒定相關抗性基因,并利用基因工程手段進行水稻抗逆育種是提高水稻抗逆和產量的重要手段。古菌生活于極端環(huán)境,蘊含著許多水稻中不具有的包括耐高/低PH、高鹽度、高溫等基因,若能將這些珍貴的基因資源開發(fā)應用到我國重要的糧食作物中,將會對農作物的常規(guī)抗逆育種帶來革命性的突破。本實驗前期,對嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌(古菌模式)進行非生物脅迫(高溫、高鹽)處理后,通過對其蛋白質組學iTRAQ分析篩選出高表達的鐵氧還蛋白(ferredoixn,Fd)氨基酸序列。在本文中,我們利用基因合成的方法,獲得了水稻中高表達的MtFd基因,進一步,構建了水稻轉化載體pCAMBIA1301-Mt Fd,通過農桿菌介導法將其轉入水稻ZH11中,分析了MtFd轉基因水稻與野生型對照植株,正常生長條件下的光合特性和農藝性狀的差異,及鹽、高溫、和低溫脅迫下轉基因植株和野生型對照的光合效率。本文主要結果如下:1.MtFd過表達載體的構建及轉基因水稻的獲得(1)根據嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌鐵氧還蛋白的氨基酸序列,通過對水稻偏愛密碼子分析,重新設計了MtFd DNA序列,交由公司進行基因合成。利用轉基因載體pCAMBIA1301,成功構建了水稻轉化載體pCAMBIA1301-MtFd。(2)利用農桿菌介導的方法,將pCAMBIA1301-MtFd轉化水稻中花11,通過潮霉素篩選和反轉錄PCR鑒定,獲得T_0代MtFd轉基因水稻植株18株。通過半定量PCR篩選出表達量較高的三個獨立株系(MtFd-1、MtFd-2、MtFd-5)進行加代種植獲得T_1代植株。2.正常生長條件下,MtFd轉基因水稻植株光合特性的測定在自然氣溫下、上午9:00-11:00,利用Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)對抽穗期水稻劍葉分別測定凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、細胞間隙CO_2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。結果表明:與野生型相比,轉基因株系Mt Fd-1、MtFd-2、MtFd-5凈光合速率(Pn)極顯著提高,分別提高51.2%、24.9%和31.2%,其中最大增加了59.97%(MtFd-1-3);而氣孔導度與光合作用速率呈現(xiàn)正比例的關系,增加幅度分別為60.5%、21.2%和28.8%;胞間CO_2和蒸騰速率均上升,但是上升的差異不顯著。這一結果表明,正常生長條件下,MtFd的異源表達提高了水稻的光合速率。3.MtFd轉基因水稻植株株高、粒長、粒寬、千粒重等農藝性狀的測量利用生物統(tǒng)計學方法對T_1代表達量較高的三個獨立株系(MtFd-1、MtFd-2、Mt Fd-5)進行株高、粒長、粒寬、千粒重等農藝性狀的測量。結果顯示,與野生型相比,轉基因植株的株高、粒寬和千粒重顯著下降,而粒長顯著增長。轉基因株系Mt Fd-1、MtFd-2、MtFd-5株高分別為野生型的86.9%、89.5%和90.4%;粒寬分別為野生型的89.3%、89.5%和91.9%;千粒重分別為野生型的84%、86.4%和90.9%;粒長分別增長了5%、5.9%和10.9%。4.MtFd轉基因水稻幼苗在非生物脅迫下光合特性的測定(1)低溫脅迫下MtFd轉基因水稻幼苗光合特性對生長至六葉期的水稻進行低溫(8℃)脅迫,結果表明:在脅迫初期(0~2d)與正常生長條件相比,MtFd轉基因株系及野生型水稻的的凈光合速率(Pn)極顯著下降,ZH11、MtFd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分別為正常生長條件下的11.8%、13.9%、21.9%、12.4%。相比野生型,轉基因株系Pn下降更快,且光合速率更低。同時,與野生型相比,轉基因株系的氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和細胞間隙CO_2(Ci)與凈光合速率(Pn)的變化趨勢一致,均出現(xiàn)明顯的下降。在脅迫后期(2~4d)MtFd轉基因株系與野生型凈光合速率(Pn)略有回升,但不顯著。同時,與野生型相比,轉基因株系的氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和細胞間隙CO_2(Ci)與凈光合速率(Pn)的變化趨勢一致,都略有回升。(2)高溫脅迫下MtFd轉基因水稻幼苗光合特性對生長至六葉期的水稻進行高溫(42℃)脅迫,結果表明:在脅迫初期(0~2d),與正常生長條件相比,MtFd轉基因株系及野生型水稻的的凈光合速率(Pn)極顯著下降,ZH11、Mt Fd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分別為正常生長條件下的60.9%、68.3%、51.9%、59.4%。與野生型相比,轉基因株系下降較為迅速,但是Pn始終維持在較高水平。但是Pn下降的同時伴隨著Gs和Ci下降和Tr上升。在脅迫后期(2~4d),MtFd轉基因株系與野生型凈光合速率(Pn)略有回升,但不顯著。同時伴隨著Gs上升和Ci、Tr的下降,但是與處理第2天相比,變化趨勢均不顯著。(3)MtFd轉基因水稻幼苗鹽脅迫下光合特性對生長至六葉期的水稻進行高鹽(150 mM)脅迫,結果表明:在脅迫初期(0~2d),與正常生長條件相比,MtFd轉基因株系及野生型水稻的的凈光合速率(Pn)極顯著下降,ZH11、Mt Fd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分別為正常生長條件下的75.4%、65.7%、82.1%和64.9%。與野生型相比,轉基因株系下降較為迅速,但是Pn始終維持在較高水平。但是Pn下降的同時伴隨著Gs和Ci上升和Tr下降。在脅迫后期(2~4d),MtFd轉基因株系與野生型凈光合速率(Pn)持續(xù)下降,同時伴隨著Gs、Ci、Tr的下降。非生物脅迫下,Mt Fd轉基因水稻幼苗的光合特性變化趨勢雖然與野生型植株相似,但變化響應似乎更為迅速,這提示我們MtFd可能通過影響光合作用來提高植株對逆境脅迫的耐性
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硫鍵相互作用，如 AGPase，F(xiàn)BPase，SBPase 等與 Calvin 循環(huán)密切相關的酶。在葉中 Fd 主要向 FNR 提供電子用于接下來 NADPH 的還原最后在用于卡爾文循環(huán)[70, 71]。而根中恰恰與此相反，F(xiàn)d 需要 FNR 提供電子，如圖 1。圖 1 Fd 在根、葉中代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of Fd in roots and leaves我們參考 Mulo (2011)文獻和浙江大學楊超等人最新研究成果[72, 73]，來總結植物 Fd 在參與不同電子的調控途徑并對蛋白結構、功能等進行探討，，如圖 2。

第 1 章 前言生驅動 ATP 的 DpH 梯度通過 ATP 合成酶合成。在電子傳輸中鏈，PSI 將給予[2Fe-2S]結構 Fd[68]。電子通過光系統(tǒng)傳輸產生減少的 Fd。Fd 降低可一步與酶鐵氧還蛋白：硫氧還蛋白還原酶（FTR）相互作用并被氧化成氧化，而硫氧還蛋白（Trx）減少[69]。只要 Trx 減少，它就會與目標酶上的特定二相互作用，如 AGPase，F(xiàn)BPase，SBPase 等與 Calvin 循環(huán)密切相關的酶。中 Fd 主要向 FNR 提供電子用于接下來 NADPH 的還原最后在用于卡爾文[70, 71]。而根中恰恰與此相反，F(xiàn)d 需要 FNR 提供電子，如圖 1。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S511

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 李林鋒;吳小鳳;劉素青;;湛江5種紅樹林樹種光合作用特性及光合固碳能力研究[J];廣西植物;2015年06期

2 楊超;胡紅濤;吳平;莫肖蓉;;高等植物鐵氧還蛋白-NADP~+氧化還原酶研究進展[J];植物生理學報;2014年09期

本文編號：2668162