【摘要】：目的:探究ras癌基因誘發(fā)肝腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,在代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上的變化特點(diǎn),為研究肝腫瘤的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷治療提供有益的線索。方法:1.將Hras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤組織和正常小鼠肝組織切成1 cm~3小塊,用冰浴的生理鹽水沖洗,立即凍存進(jìn)液氮中用于后續(xù)氣相質(zhì)譜分析和總RNA提取實(shí)驗(yàn)。剩余的組織存放在10%福爾馬林液中,用于組織病理學(xué)鑒定,確認(rèn)是否可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.制備氣相色譜-質(zhì)譜分析所需樣本,進(jìn)行GC-MS兩個(gè)衍生化步驟,混合后上機(jī)待測(cè)。隨后進(jìn)行GC-TOF-MS檢測(cè);然后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備的分析數(shù)據(jù)分析,用LECO Corporation和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)的色度TOF4.3X軟件用來(lái)區(qū)分出原始物質(zhì),數(shù)據(jù)用基線過(guò)濾及基線校準(zhǔn)、峰值對(duì)齊、去卷積分析、峰值識(shí)別和峰值區(qū)域集成,將產(chǎn)生的物質(zhì)列表輸入Pirouette software(模式識(shí)別,華盛頓伍丁維爾)用于多變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將氣相液相色譜-質(zhì)譜列出的物質(zhì)數(shù)據(jù)表輸入MSEA作為代謝物列表,選擇小鼠通路庫(kù),同時(shí)ORA算法選擇超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行代謝物富集分析。3.檢測(cè)兩組肝組織樣本中不同基因mRNA的表達(dá)量。抽提待測(cè)樣本的總RNA,用TruSeq RNA LT樣本準(zhǔn)備試劑盒制備測(cè)序文庫(kù),測(cè)序用Illumina HiSeq 2000。對(duì)UCSC Mouse Reference Genome(http://genome.ucsc.edu/)進(jìn)行閱讀比對(duì)用Tophat v1.3.2軟件。DAVID v6.7數(shù)據(jù)庫(kù)用于測(cè)序數(shù)據(jù)分析和KEGG富集分析。4.實(shí)驗(yàn)室對(duì)部分代謝物用試劑盒進(jìn)行檢測(cè),包括:NADPH、甘油三酯、膽固醇、丙酮酸、乳酸、膽汁酸、谷胱甘肽和活性氧。以上代謝物檢測(cè)方法嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所有待測(cè)樣本進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1.肝癌當(dāng)中富含脂質(zhì)與大體表型一致,HCC的脂質(zhì)生物合成是顯著增強(qiáng)的;2.糖酵解途徑和檸檬酸穿梭的增強(qiáng)提供了充足的乙酰輔酶A;強(qiáng)化的磷酸戊糖途徑供應(yīng)非常多的NADPH;3.脂質(zhì)從頭合成相關(guān)性關(guān)鍵性酶活性都上調(diào);與膽汁酸合成有關(guān)的重要酶的活性全下調(diào);4.肝癌組織與正常肝組織相比較,NADPH、丙酮酸、甘油三酯、膽固醇以及谷胱甘肽含量顯著升高,乳酸含量顯著性下降,而活性氧維持在正常水平。結(jié)論:在ras癌基因誘導(dǎo)的肝癌中,脂質(zhì)代謝、糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、檸檬酸穿梭、膽汁酸合成和氧化還原穩(wěn)態(tài)有顯著紊亂,而且這些發(fā)生變化的代謝過(guò)程對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展和病理特點(diǎn)有起到關(guān)鍵性作用。
【圖文】：

組織病理學(xué)鑒定由 ras 癌基因誘導(dǎo)的肝癌組織中代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組因雄性小鼠肝腫瘤組織和正常雄性小鼠肝組織作為本和組織病理學(xué)研究結(jié)果與我們之前的研究報(bào)道一色病灶，病灶呈圓形或橢圓形伴有豐富血管，質(zhì)地ras 轉(zhuǎn)基因雄鼠肝臟病灶是突出肝表面或嵌入肝臟內(nèi)雄性小鼠肝組織鮮紅色，質(zhì)地有彈性且未見(jiàn)病灶（顯示肝癌（通常直徑大于 5 mm）有腫瘤細(xì)胞小梁排跡象和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)跡象（圖 1C）。正常肝組織中和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 1D）。所有的取材實(shí)驗(yàn)動(dòng)物其別了 8 只 ras 轉(zhuǎn)基因雄鼠肝癌組織和 8 只正常雄鼠行后續(xù)研究。

圖 2 對(duì)肝癌組織和正常肝組織的代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行 PCA，PLS-DA 和 OPLS-DA 分析注釋 2：（A）正常肝組織（用黑色圓點(diǎn)表示），肝癌組織（用藍(lán)色菱形表示），基于兩種組織的代謝物配置數(shù)據(jù)進(jìn)行 PCA 繪制評(píng)分圖。主要成分 PC1 (t[1]) 和PC2 (t[2])分別描述了 33.6%和 15.6%變異，每組 n=8。（B）PLS-DA 評(píng)分顯示出正常肝組織（用黑色圓點(diǎn)表示）和肝癌組織（用藍(lán)色菱形表示）是完全分離的兩種組織。分類(lèi)參數(shù)：R2X (cum) = 0.539，R2Y (cum) = 0.951，，and Q2 (cum) = 0.746。（C）PLS-DA 模型驗(yàn)證對(duì)正常肝組織（用黑色圓形表示）和肝癌組織（用藍(lán)色菱形表示）進(jìn)行 200 次數(shù)據(jù)隨機(jī)排列，顯示 R2 低于 0.515 并且 Q2 低于 0.173。（D）OPLS-DA 顯示出正常肝組織（用黑色圓形表示）和肝癌組織（用藍(lán)色菱形表示）之間區(qū)別的變量分?jǐn)�。分�?lèi)參數(shù)：R2X (cum) = 0.816，R2Y (cum) = 0.996，和 Q2 (cum) = 0.874。3 PCA 篩選出的肝癌組織和正常肝組織之間有差異的物質(zhì)除了基于樣本組成的成分得分圖以外，PCA 還可以根據(jù)代謝物含量生成一個(gè)
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2668027