【摘要】：泛素蛋白酶體途徑與配子體自交不親和密切相關(guān),其通過(guò)降解一些特異蛋白參與很多顯花植物的自交不親和過(guò)程,而泛素結(jié)合酶UBE2在泛素蛋白酶體途徑中起著重要的作用。課題組前期從香水檸檬自交不親和花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到兩個(gè)泛素結(jié)合酶家族UBE2A和UBE2I同源基因片段,為了弄清該基因的特性以及與檸檬自交不親和的關(guān)系,開展了本研究。本研究以香水檸檬(自交不親和)和白花檸檬(自交親和)為試材,根據(jù)從檸檬花轉(zhuǎn)錄組得到的UBE2A和UBE2I同源基因片段,采用同源克隆的方法獲得了香水檸檬和白花檸檬2個(gè)品種的UBE2A和UBE2I同源基因的ORF和DNA全長(zhǎng),對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,對(duì)其在兩個(gè)檸檬不同組織器官以及自花授粉與雜交授粉后不同時(shí)間段的表達(dá)模式進(jìn)行分析,并對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究。其主要結(jié)果如下:1.通過(guò)測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn),香水檸檬UBE2A同源基因的ORF全長(zhǎng)是564 bp,DNA全長(zhǎng)為1691 bp;白花檸檬UBE2A同源基因的ORF全長(zhǎng)為315bp,較香水檸檬短249 bp,DNA全長(zhǎng)為887 bp,較香水檸檬短804 bp。香水檸檬和白花檸檬的泛素連接酶UBE2I同源基因的ORF長(zhǎng)度均為483bp,兩個(gè)品種ORF全長(zhǎng)僅有一個(gè)堿基的差異;其同源基因的DNA序列均為2267 bp。2.利用生物學(xué)在線網(wǎng)站及軟件對(duì)UBE2A和UBE2I同源基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),香水檸檬UBE2A同源基因共含有7個(gè)外顯子,其長(zhǎng)度分別為:44 bp,81 bp,115 bp,52 bp,129 bp,105 bp,38 bp。6 個(gè)內(nèi)含子,其長(zhǎng)度分別為:166 bp,145 bp,261 bp,366 bp,182 bp,7 bp。香水檸檬UBE2A同源基因的ORF全長(zhǎng)為564 bp,編碼187個(gè)氨基酸,由20種氨基酸組成,其中含量最多的三種氨基酸分別是:Ser21(21,11.2%)、Asp18(18,9.6%)和 Glu16(16,8.6%);其理論分子量為 21200.77784 Da,等電點(diǎn)為4.29。香水檸檬UBE2A泛素連接酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)有6個(gè)α螺旋,4個(gè)β折疊,10個(gè)無(wú)規(guī)卷曲。泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示香水檸檬UBE2A氨基酸序列的第149位氨基酸存在較高泛素化的可能性(score 0.85),第14(score 0.72)和148位(score 0.79)氨基酸存在中等的被泛素化的可能性,第133位(score 0.66)氨基酸存在較低的被泛素化的可能性。整條肽鏈呈現(xiàn)親水性,不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。在白花檸檬中,UBE2A同源基因含有4個(gè)外顯子,長(zhǎng)度分別為:44bp,81 bp,115 bp,75bp,3個(gè)內(nèi)含子,長(zhǎng)度分別為:166bp,145bp,261bp。在香水檸檬DNA的第四個(gè)段內(nèi)含子中的第885-887位堿基為TGA,是白花檸檬UBE2A的終止密碼子。白花檸檬UBE2A同源基因的ORF全長(zhǎng)為315 bp,編碼104個(gè)氨基酸,由20種氨基酸組成,含量最多的五種氨基酸分別是:Ser(11,10.6%),Ile(9,8.7%),Val(8,8.7%),Lys(8,8.7%),Pro(8,8.7%)。白花檸檬UBE2A泛素連接酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)有3個(gè)α螺旋,6個(gè)β折疊,7個(gè)無(wú)規(guī)卷曲。理論分子量為11845.73124Da,等電點(diǎn)為5.13。整條肽鏈呈現(xiàn)疏水性,不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示白花檸檬UBE2A同源基因氨基酸序列中不存在泛素化的可能性。檸檬UBE2A同源基因蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域均為:UBCc superfamily。香水檸檬和白花檸檬UBE2I同源基因中均含有5段個(gè)內(nèi)含子,長(zhǎng)度分別為70bp、81bp、157bp、112bp、63bp。4 個(gè)外顯子,長(zhǎng)度分別為 77bp、1145bp、110bp、452bp。在第2、4個(gè)內(nèi)含子序列中存在兩個(gè)TATA盒樣結(jié)構(gòu)(TATAA)框的結(jié)構(gòu),也許這種序列與內(nèi)含子的功能密切相關(guān)。香水檸檬和白花檸檬UBE2I同源基因的ORF全長(zhǎng)均為483bp,共編碼160個(gè)氨基酸,氨基酸組成及含量無(wú)差異。均由20種氨基酸組成,其中含量最高的三種氨基酸分別是Pro(16,10%),Gly(14,8.75%),Leu(13,8.125%)。其理論分子量為17981.47444Da,等電點(diǎn)為7.64。檸檬UBE2I同源基因蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)?UBCcsuperfamily。檸檬UBE2I泛素連接酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)有4個(gè)α螺旋,7個(gè)β折疊,10個(gè)無(wú)規(guī)卷曲。泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示檸檬UBE2I氨基酸序列的第28位氨基酸(Score為0.70)存在中等被泛素化的可能性,第111位(Score為0.64)氨基酸存在較低的被泛素化的可能性。SUMO修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示UBE2I的第28和54位氨基酸存在SUMO化修飾的可能性。整條肽鏈呈現(xiàn)親水性,不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。3.利用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)香水檸檬UBE2A、UBE2I基因在不同組織和香水檸檬自交、雜交授粉后不同時(shí)間段的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,UBE2A和UBE2I同源基因在香水檸檬受試的11個(gè)組織中均表達(dá),不同組織中的表達(dá)情況存在差異。其中UBE2A在花柱和花粉中有較高的表達(dá)量,在花柱中表達(dá)量最高,在莖、花托、子房中的表達(dá)量相對(duì)較低。UBE21在花粉、花絲的表達(dá)量較高,在花粉中表達(dá)量最高,在花托和老莖中的表達(dá)量相對(duì)較低。UBE2A在香水檸檬自交和雜交后不同時(shí)間段柱頭中的表達(dá)分析顯示,在自交授粉0-10h后,表達(dá)量略有上升,10h的表達(dá)量約為雜交授粉的2.5倍。在自交授粉10-15 h表達(dá)量出現(xiàn)下降,在自交授粉后15 h表達(dá)量下降至0 h的表達(dá)量水平,與雜交時(shí)表達(dá)量差不多;在自交授粉15h-1d表達(dá)量略有上升;在自交授粉后1-2d表達(dá)量顯著上升,2d的達(dá)到最大值,約為雜交后的25倍。UBE2E在柱頭中的表達(dá)分析顯示在自交授粉0 h-10 h后,表達(dá)量略有上升,10 h的表達(dá)量約為雜交授粉的4.5倍;在自交授粉10-20h表達(dá)量出現(xiàn)下降,在自交授粉后20h表達(dá)量下降至Oh的表達(dá)量水平,約為雜交時(shí)表達(dá)量的3倍;在自交授粉1d后表達(dá)量持續(xù)上升,在自交授粉4d時(shí),表達(dá)量約為雜交后的5.5倍。綜上,結(jié)果顯示UBE2A和UBE21同源基因可能參與香水檸檬自交不親和而反應(yīng)。4.將構(gòu)建的瞬時(shí)表達(dá)載體P1300-GFP-UBE2A和P10300-GFP-UBE2I轉(zhuǎn)化到本氏煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),共培養(yǎng)1-2d后,通過(guò)多光子激光共聚焦顯微鏡,借助綠色熒光蛋白GFP的熒光信號(hào)確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布。結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)P1300-GFP-UBE2A的煙草葉片細(xì)胞中,綠色熒光蛋白主要分布在細(xì)胞核中。在轉(zhuǎn)P1300-GFP-UBE2I的煙草葉片細(xì)胞中,綠色熒光蛋白主要分布于細(xì)胞膜中。5.構(gòu)建酵母重組質(zhì)粒 pGADT7-UBE2A,pGADT7-UBE2I 和 pGBKT7-F-box,并對(duì)pGBKT7-F-box進(jìn)行了自激活和毒性檢測(cè)。證明了重組表達(dá)載體pGBKT7-F-box無(wú)自激活性和毒性。
【圖文】：

圖１－１本實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｔｈｅ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ逡逑

Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ａｔｌａｓ邋ｏｆ邋ｐｌ３００－ＧＦＰ逡逑２．１．３酶及生化試劑逡逑由大連ＴａＫａＲａ公司購(gòu)買ＤＮＡＭａｋｅｒ、Ｍ－ＭＬＶ逆轉(zhuǎn)錄酶、ｐＭＤ１８－Ｔ載體、實(shí)時(shí)逡逑熒光定量試劑盒ＳＹＢＲ邋Ｐｒｅｍｉｘ邋Ｄｉｍｅｒ邋Ｅｒａｓｅｒ、ＤＮＡ小量純化試劑盒（ＭｉｎｉＢＥＳＴ邋Ｐｌａｓｍｉｄ逡逑Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ邋Ｖｅｒ．４．０）、ＤＮＡ邋片段純化試劑盒（ＭｉｎｉＢＥＳＴＤＮＡ邋Ｆｒａｇｍｅｎｔ邋Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑Ｋｉｔ邋Ｖｅｒ．４．０）、酵母雙雜交系統(tǒng)（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ邋Ｇｏｌｄ邋Ｙｅａｓｔ邋Ｔｗｏ－Ｈｙｂｒｉｄ邋Ｓｙｓｔｅｍ）等相關(guān)實(shí)逡逑驗(yàn)耗材；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司購(gòu)買Ｂｉｏｓｐｉｎ膠回收試劑盒、瓊脂糖、逡逑ｄＮＴＰ、ＭｇＣ１２、ＫＯＨ、ＨＣ１、乙醇、ＭＥＳ、乙酰丁香酮、ＤＭＳＯ、氨芐青霉素、卡那霉逡逑素、利福平、有機(jī)溶劑過(guò)濾膜、ｌｍＬ注射器及引物合成、測(cè)序等業(yè)務(wù)；由衡陽(yáng)原野實(shí)逡逑業(yè)有限公司購(gòu)買醫(yī)用酒精消毒液；由北京天根生化科技有限公司購(gòu)買ＴＩＡＮＧＥＮ多糖多逡逑酷植物總ＲＮＡ提取試劑盒（ＲＮＡｐｅｒｐ邋Ｐｕｒｅ邋Ｐｌａｎｔ邋Ｋｉｔ）等藥品；由Ｔｈｅｒｍｏ公司購(gòu)買Ｄｒｅａｍ逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S666.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2662444