發(fā)布時(shí)間：2020-05-13 07:04

【摘要】：過氧化氫酶(Catalase,CAT)又稱為觸酶,是一種重要的末端氧化酶,在許多不同生物對(duì)非生物脅迫的耐受過程中起著重要的作用。過氧化氫酶由CAT基因編碼,目前已在一系列物種中克隆。黃瓜是葫蘆科中的重要蔬菜作物之一,對(duì)CAT酶的功能還知之甚少。為了探討黃瓜過氧化氫酶的功能,以華北型黃瓜9930為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)黃瓜CAT家族基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并采用RT-PCR和熒光定量PCR的方法對(duì)黃瓜CAT家族基因進(jìn)行了組織表達(dá)分析和逆境脅迫下的表達(dá)量分析。進(jìn)一步通過RT-PCR的方法克隆了Cs CAT3基因;經(jīng)過酶切、連接和轉(zhuǎn)化成功構(gòu)建了p ET32a-CSCAT3表達(dá)載體,通過原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Cs CAT3基因進(jìn)行抗逆性功能分析。主要結(jié)果如下:1.共鑒定出4個(gè)非冗余CAT基因。根據(jù)其ID號(hào),分別為命名為Cs CAT1-Cs CAT4。進(jìn)化分析表明,Cs CAT1和Cs CAT2基因分別歸屬III和I亞類,另2個(gè)基因Cs CAT3和Cs CAT4屬于II亞類,它們與擬南芥比水稻和楊樹CAT基因的親緣關(guān)系要近。2.Cs CAT基因表達(dá)具有明顯的組織特異性。對(duì)根、莖、葉、花、果等組織的RT-PCR分析表明:Cs CAT1-Cs CAT3在各個(gè)組織中都表達(dá),但Cs CAT4在任何組織中都不表達(dá)。Cs CAT1與Cs CAT2基因的表達(dá)模式相似,在根、葉和果實(shí)中都表達(dá)量較高。Cs CAT3在莖、葉、花和果實(shí)中表達(dá)量較高,在根中表達(dá)信號(hào)較弱。3.采用熒光定量PCR分析表明:不同脅迫處理(熱、冷、PEG、Na Cl、H2O2和ABA)下Cs CAT3的表達(dá)有不同程度的促進(jìn)作用。4.采用RT-PCR克隆了Cs CAT3基因,成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體,并在BL21中高效表達(dá)。Cs CAT3蛋白的分子量為77 KD左右,原核表達(dá)分析表p ET-Cs CAT3最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h、IPTG濃度為1 m M、最佳菌液誘導(dǎo)濃度為OD600=0.6,Cs CAT3為可溶性蛋白。5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌抗逆性結(jié)果表明:Cs CAT3重組蛋白在不同脅迫條件下均能增強(qiáng)原核大腸桿菌的生長(zhǎng)能力,Cs CAT3對(duì)非生物脅迫具有重要的耐受性。
【圖文】：

1.3.2 研究意義在調(diào)控黃瓜逆境生長(zhǎng)發(fā)育方面，CsCAT3 是一個(gè)新基因，本研究希望通過對(duì)該因的生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究，來探索黃瓜逆境生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理。本研究是黃CsCAT3 基因在脅迫條件下的表達(dá)量出現(xiàn)顯著變化的基礎(chǔ)上，構(gòu)建原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)大腸桿菌 BL21（DE3），，通過分析重組菌的抗冷、熱、干旱和耐鹽能力，來研究蛋白的功能，在理論上為進(jìn)一步闡述 CsCAT3 的抗逆機(jī)制，在應(yīng)用上為選育出新的瓜抗性品種奠定基礎(chǔ)和指明方向。

個(gè)蛋白的親水系數(shù)均小于0，說明它們均為親水性蛋白.707，小于其它三個(gè)CAT蛋白，親水系數(shù)最強(qiáng)；CsCAT4親水于其它3個(gè)蛋白，親水性最弱。從染色體定位分部來看位于4號(hào)染色體上，CsCAT3基因位于6號(hào)染色體上，而C16（圖2-1）。表 2-1 黃瓜 CAT 基因及編碼蛋白的基本信息le2-1 Basic information of the CAT genes and encoded proteins in 列號(hào)uenc ID基因組DNAlength(bp)預(yù)測(cè)蛋白（Predictive protein）chrom長(zhǎng)度Length(aa)等電點(diǎn)pI分子量MW (KD)親水系數(shù)GRAVY14901 2818 536 6.1 62.07 -0.512 Chr4: 114900 3451 458 6.77 53.41 -0.707 Chr4: 113194 3296 487 6.84 56.11 -0.570 Chr6: 122770 2234 744 5.77 82.79 -0.507 Scaffold
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S642.2

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本文編號(hào)：2661590