【摘要】：花粉壁能夠保護(hù)花粉粒不受外界環(huán)境破壞,并幫助促進(jìn)花粉與柱頭識(shí)別和水合以完成受精過(guò)程。成熟花粉壁分為花粉外壁和花粉內(nèi)壁,花粉外壁又可分為外壁外層和外壁內(nèi)層。模式植物擬南芥花粉的外壁外層是由孢粉素構(gòu)成的T字形結(jié)構(gòu)和油脂類為主要成分的含油層組成。孢粉素是由多種化合物聚合形成的復(fù)合體,其成分復(fù)雜而又性質(zhì)堅(jiān)韌,對(duì)極端環(huán)境有極強(qiáng)的抗性。目前研究推測(cè)孢粉素的主要成分是長(zhǎng)鏈脂類衍生物和芳香族化合物。近年來(lái)通過(guò)分子遺傳學(xué)研究鑒定出幾個(gè)參與孢粉素成分生物合成的基因,酯酰輔酶A合成酶ACOS5、細(xì)胞色素P450羥化酶家族成員CYP703A2與CYP704B1、查爾酮合成酶家族成員PKSA與PKSB、多聚α-吡喃酮還原酶TKPR1/2以及酯酰輔酶A還原酶MS2均參與了孢粉素成分的合成,并通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)推測(cè)這些基因參與形成了一條孢粉素前體成分合成的路徑。然而關(guān)于這些基因如何受到精確調(diào)控從而發(fā)揮各自生物學(xué)功能的研究,目前僅有少量且片面的研究。擬南芥花藥絨氈層細(xì)胞為花粉壁的發(fā)育提供了原料,目前研究認(rèn)為孢粉素前體成分是在絨氈層細(xì)胞內(nèi)由上述基因編碼的功能酶參與合成并轉(zhuǎn)運(yùn)至小孢子表面沉積形成花粉外壁外層結(jié)構(gòu)。我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一條存在于絨氈層細(xì)胞內(nèi)的遺傳調(diào)控通路DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1。MS188是MYB超級(jí)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,ms188突變體花粉外壁外層T字形結(jié)構(gòu)明顯缺失,而外壁內(nèi)層正常存在,暗示MS188可能參與調(diào)控孢粉素的生物合成。已報(bào)道bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子AMS能夠在體內(nèi)結(jié)合PKSB和TKPR1的啟動(dòng)子,MS188能夠與AMS相互作用共同調(diào)控并激活CYP703A2的表達(dá)。在本文中,我們首先通過(guò)構(gòu)建孢粉素合成基因融合GFP標(biāo)簽序列的轉(zhuǎn)基因植株,觀察孢粉素合成功能酶的蛋白定位,發(fā)現(xiàn)孢粉素合成酶早期定位于絨氈層細(xì)胞,并隨花藥發(fā)育進(jìn)入藥室腔中,暗示孢粉素成分可能在藥室腔中繼續(xù)進(jìn)行生物合成與加工,最終沉積于小孢子表面。隨后我們分析了dyt1、tdf1、ams和ms188突變體植株花序的基因芯片數(shù)據(jù),并以定量PCR實(shí)驗(yàn)輔助驗(yàn)證了孢粉素合成基因PKSA、PKSB、MS2和CYP703A2處于轉(zhuǎn)錄因子MS188下游,而ACOS5、CYP704B1、TKPR1和TKPR2處于AMS下游。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)分別在體內(nèi)和體外證明MS188能夠結(jié)合在PKSA、PKSB、MS2、ACOS5和TKPR1啟動(dòng)子上,并且MS188同樣能夠在體內(nèi)結(jié)合CYP774B1的啟動(dòng)子。進(jìn)一步通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MS188能夠激活PKSA、PKSB、MS2、TKPR1、ACOS5和CYP704B1的表達(dá);然而AMS不能顯著激活TKPR1和ACOS5的表達(dá),對(duì)CYP704B1的激活能力明顯弱于MS188,表明MS188是調(diào)控孢粉素合成基因的核心轉(zhuǎn)錄因子。AMS與MS188共同存在時(shí),能夠更強(qiáng)效激活CYP704B1和TKPR1的表達(dá),結(jié)合前文AMS與MS 188共同激活CYP703A2表達(dá)的結(jié)果,我們推測(cè)MS188在AMS的輔助下共同調(diào)控了孢粉素的生物合成。進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建MS188-SRDX顯性抑制轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn),在AMS的蛋白表達(dá)不受影響而MS188功能缺失時(shí),ACOS5、CYP704B1和TKPR1/2的表達(dá)明顯下調(diào)。在ams突變體中,當(dāng)AMS功能缺失時(shí),MS188的正常表達(dá)能夠顯著恢復(fù)PKSA、PKSB、ACOS5、CYP704B1和TKPR 的表達(dá),而 MS2 的表達(dá)則與CYP703A2相同,僅得到部分恢復(fù)。這些結(jié)果暗示在絨氈層中還存在其他MYB與bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子參與MS188和AMS對(duì)孢粉素合成基因的調(diào)控。我們通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)bHLH010能夠與MS188相互作用,這一結(jié)果支持我們的推測(cè)�；谝陨蠈�(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文中我們論述了擬南芥花藥絨氈層中可能存在以轉(zhuǎn)錄因子MS188為核心形成的多元轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體參與調(diào)控孢粉素合成基因表達(dá)的機(jī)制,以及AMS與MS 188可能形成feed forward loop模式快速調(diào)控孢粉素合成基因表達(dá),隨后孢粉素合成酶大量分泌進(jìn)入藥室腔促進(jìn)孢粉素的快速生物合成的機(jī)制。這些機(jī)理的研究幫助我們更深入地理解絨氈層轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花粉壁形成的生物學(xué)過(guò)程,以及該過(guò)程在植物進(jìn)化中對(duì)于植物完美保護(hù)自身花粉進(jìn)而正常繁衍后代的重要意義。
【圖文】：

上海師范大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑第１章前言逡逑１．１花藥形態(tài)及其發(fā)育過(guò)程逡逑十字花科植物擬南芥是己經(jīng)完成全基因組測(cè)序的經(jīng)典模式植物，其典型的生逡逑殖器官邐花，是由四個(gè)基礎(chǔ)部分組成：花瓣（ｐｅｔａｌ）、萼片（ｓｅｐａｌ）、雌蕊（ｐｉｓｔｉｌ）逡逑和雄蕊（ｓｔａｍｅｎ）（圖丨－１，ａ）。雄蕊是種子植物產(chǎn)生花粉的場(chǎng)所，分為花絲（ｆｉｌａｍｅｎｔ）逡逑和花藥（ａｎｔｈｅｒ）兩個(gè)部分（圖丨－１，邋ｂ）�；ńz呈柄狀，是由表皮與維管束構(gòu)成，位逡逑于雄蕊基部，主要起到支撐花藥并輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的作用�；ㄋ幨切廴镏凶铄义现匾慕M成部分，外部呈四個(gè)葉狀形態(tài)；內(nèi)部則被藥隔分成兩個(gè)藥室并各含１？逡逑２個(gè)花粉囊，由結(jié)締組織連接并依附于花絲的維管束上。在花粉囊中，小孢子發(fā)逡逑生到花粉成熟要經(jīng)過(guò)孢子體細(xì)胞層的分化，減數(shù)分裂，配子體發(fā)育等一系列過(guò)程，逡逑待花粉成熟時(shí)，花粉囊自行開(kāi)裂，散出花粉＝逡逑

圖１－３花粉壁發(fā)育中絨氈層的功能（Ｐｉｆｆａｎｅｌｌｉｅ／ａ／．，邋１９９８）逡逑Ａ：減數(shù)分裂后，，小孢子從四分體釋放，絨氈層分泌小囊泡及油體等物質(zhì)參與花粉外壁發(fā)育；逡逑Ｂ小孢子第一次有絲分裂期結(jié)束后，花粉外壁結(jié)構(gòu)基本形成，絨氈層持續(xù)分泌各種營(yíng)養(yǎng)物逡逑質(zhì)以供給花粉發(fā)育；Ｃ絨氈層在發(fā)育晚期將自身降解形成的造油體及細(xì)胞質(zhì)脂體提供給花逡逑粉；Ｄ花粉壁的油脂類結(jié)構(gòu)。Ｔａｐｅｔｕｍ：纟戎毯層；Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：囊泡；Ｎｕｃｌｅｉ：細(xì)胞核；ｐｌａｓｔｉｄ：逡逑質(zhì)體；Ｖａｃｕｏｌｅ：液泡；Ｌｉｐｉｄｉｃ邋ｂｏｄｉｅｓ：含油體；Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｌｉｐｉｄ邋ｂｏｄｙ：細(xì)胞質(zhì)脂體；Ｓｅｃｒｅｔｅｄ逡逑ｆｉｂｒｉｌｓ：分泌的纖維成分；Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌ：營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞；Ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌ：生殖細(xì)胞；Ｅｘｉｎｅ：花逡逑粉外壁；ｒＥＲ：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Ｅｌａｉｏｐｌａｓｔ：造油體；Ｏｉｌ邋ｂｏｄｙ：油體；Ｐｏｌｌｅｎ邋ｃｏａｔ：花粉包被。逡逑１．２．２絨氈層功能逡逑絨氈層在花藥發(fā)育中起到不可替代的多重功能。首先，從小孢子的減數(shù)分裂逡逑開(kāi)始直至絨氈層完全降解的過(guò)程中絨氈層細(xì)胞能夠持續(xù)供給營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)絨氈層細(xì)胞逡逑轉(zhuǎn)入分泌型后其細(xì)胞質(zhì)濃密，富含與合成及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、逡逑質(zhì)體、微體和脂質(zhì)體等，并且能通過(guò)分泌小泡來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)脂類、蛋白質(zhì)及碳水化合物逡逑等（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ，邋１９９０）。逡逑其次絨氈層能夠合成構(gòu)成花粉外壁外層的孢粉素前體、構(gòu)成花粉外壁內(nèi)層的逡逑
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2

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1 劉炳侖;孢粉素[J];化石;1994年02期

2 ;中科院華南植物園首次發(fā)現(xiàn)專性傳粉昆蟲(chóng)能分解孢粉素[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年09期

3 ;上海師范大學(xué)揭示花粉壁孢粉素合成的調(diào)控機(jī)制[J];蔬菜;2018年08期

4 劉炳侖;關(guān)于孢粉素的研究進(jìn)展[J];植物學(xué)通報(bào);1985年05期

5 朱o

本文編號(hào)：2642034