【摘要】：白樺三萜因其具有的抗腫瘤和抗艾滋病毒等活性,而成為最有潛力的藥物制劑,具有重要的應用前景。轉錄因子具備通過調控途徑基因的表達量,進而調節(jié)次生代謝物質產(chǎn)量的功能,是常用的從整體改造代謝途徑的一種有效工具。本研究以白樺(Betula platyphlla Suk.)為材料,結合實驗室前期篩選的響應MeJA和SA信號的MYB轉錄因子基因,擬克隆與白樺三萜合成相關的BpMYB21和BpMYB61基因全長及啟動子序列,并進行生物信息學分析,表達特異性分析,研究其在白樺和酵母中的表達特征及功能。以期為白樺三萜類物質代謝工程遺傳改造和生物技術利用提供技術支持和理論依據(jù)。本研究結果如下:1.利用特異引物和RT-PCR技術,從白樺組培苗cDNA中克隆了白樺BpMYB21和BpMYB61基因的cDNA全長。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),BpMYB21基因的ORF全長為1014 bp,編碼337個氨基酸,該蛋白質具有一個MYB binding site和兩個SANT超家族,為親水性蛋白,與胡桃MYB30-Like具有64%的相似性,與胡楊MYB86的相似性為61%。BpMYB61基因的ORF長為1203bp,編碼400個氨基酸,具有兩個MYB binding site保守結構域,為親水性蛋白,與光皮樺myb-Like的同源性最高為97%。系統(tǒng)進化樹表明,BpMYB21轉錄因子與胡桃,而BpMYB61與光皮樺MYB基因在一個分支上。進一步分析表明,本研究獲得的BpMYB21是白樺MYB家族中的新成員。2.利用Real-time PCR技術,分析了BpMYB21和BpMYB61基因時空及激素處理表達模式。結果表明,在六月中旬至九月中旬期間,三年樹齡的白樺植株中,BpMYB21和BpMYB61基因均在7、8月份表達量較高。兩個基因的組織特異性表達分析表明,莖和葉中的表達水平顯著高于根中的表達水平。BpMYB21和BpMYB61兩個基因對不同激素誘導的響應模式差異顯著。在葉中,除ABA和GA處理12h時BpMYB21基因的表達量最高,其余處理均為6h時BpMYB21基因表達量最高;在莖中,ABA和乙烯在處理12h時BpMYB21基因的表達量達到最高,其余處理均為6h時BpMYB21基因的表達量達到最高。在葉中,除了乙烯和傷害處理6h,BpMYB61基因的表達量最高外,其余處理均在12h,基因的表達量達最高;在莖中,ABA、MeJA、SA的處理使BpMYB61的表達量下調,而GA、乙烯、傷害處理上調BpMYB61基因的表達。通過亞細胞定位實驗,明確白樺BpMYB21和BpMYB61在細胞核和細胞膜中均有表達。3.通過染色體步移技術分別擴增得到長度為1302bp和850bp的BpMYB21、BpMYB61基因的啟動子序列。這兩個基因的啟動子序列分析結果表明,BpMYB21和BpMYB61啟動子包含TATA盒和CAAT盒等基本元件。同時得到多個植物激素應答元件,如赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸響應元件。還存在干旱、熱脅迫、厭氧菌誘導響應元件等防御與脅迫相關的表達元件等。此外發(fā)現(xiàn),BpMYB21和BpMYB61基因啟動子序列中還存在MYB轉錄因子結合的位點MBS元件以及bHLH轉錄因子的結合位點G-Box元件,暗示兩個轉錄因子之間及與bHLH類轉錄因子可能存在互作。4.以pYES3/CT質粒為載體分別得到BpMYB21和BpMYB61的酵母表達載體,分別轉化INVScl,INVScl-pYES2-SS,INVScl-pYES2-SE酵母菌株。重組酵母細胞中的角鯊烯和總三萜含量分析表明,與對照INVScl-pYES3酵母菌株相比,上述六種重組酵母菌中的角鯊烯和總三萜含量均有不同程度提高,其中BpMYB21重組酵母INVScl-pYES-MYB21-SS角鯊烯含量最高,比對照菌株INVScl-pYES3提高了 89%;在BpMYB61重組酵母INVScl-pYES3-MYB61中角鯊烯含量最高,比對照酵母INVScl-pYES3提高了78%;BpMYB21重組酵母INVScl-pYES-MYB21-SS中總三萜含量比對照酵母INVScl-pYES3提高20%;BpMYB61重組酵母INVScl-pYES3-MYB61總三萜含量比對照INVScl-pYES3 酵母提高 23%。5.利用 pCAMBIA1303-BpMYB21 和 pCAMBIA1303-BpMYB61 農(nóng)桿菌分別侵染白樺組培苗的葉片、葉柄和莖段,分別獲得pCAMBIA1303-BpMYB21和pCAMBIA1303-BpMYB61抗性植株44株和45株,經(jīng)PCR鑒定分別各獲得4株和7株轉基因苗。利用實時熒光定量 PCR 檢測 pCAMBIA1303-BpMYB21 和 pCAMBIA1303-BpMYB61 轉基因白樺苗中均有不同程度上調。在轉基因植株MYB21-44中,三萜途徑關鍵酶基因的相對表達量均表現(xiàn)出不同程度的上調,其中上調效果最為顯著的是HMGR基因,是對照組的28.24倍;而SE基因的表達量出現(xiàn)了輕微的下調。在轉基因植株MYB61-5中,三萜途徑關鍵酶基因FPS和SS的相對表達量出現(xiàn)上調,分別比對照提高了 35%和13%,而HMGR、BPW、SE、BPY的基因表達量均出現(xiàn)不同程度的下調,其中下調效果最為顯著的為BPY基因,比對照下調了 84%。暗示兩個基因在調控三萜合成中的功能不同。6.從白樺三萜合成關鍵酶基因中篩選得到6種MYB轉錄因子結合的順式作用元件,并成功構建了 pHis-元件的誘餌載體。實驗成功的構建了捕獲載體pGADT7-Rec2-MYB21和pGADT7-Rec2-MYB61,互作實驗結果表明,1號和4號元件分別存在于SE基因啟動子和BPX基因的啟動子,兩個元件與BpMYB21存在微弱的互作,而與BpMYB61存在較強的互作。暗示BpMYB21、BpMYB61對SE基因和BPX基因具有調控作用,而BpMYB61的調控作用可能更強。
【圖文】：

圖１－２植物萜類生物合成途徑｜４４］逡逑１．３植物次生代謝途徑的調控逡逑植物中有蛋白質等植物初級代謝產(chǎn)物，還有萜類等植物次生代謝產(chǎn)物，，但這些活性逡逑成分在植物中的含量一般都很低｜４５］，因此目前亟待解決的問題就是如何提高植物次生代逡逑謝產(chǎn)物的含量。眾所周知，植物次生代謝產(chǎn)物的合成不是一個單一的過程，其中有很多逡逑調控因子發(fā)揮著作用，例如生物和非生物因子［４６］。例如，植物萜類次生代謝產(chǎn)物的合逡逑成，不僅受到ＭＶＡ途徑多種酶促反應和關鍵酶基因表達的影響，更受到如茉莉酸逡逑（ＪＡ）、水楊酸（ＳＡ）等激素１４］這類的外源誘導子的誘導以及如轉錄因子ｂＨＬＨ、逡逑ＷＲＫＹ、ＡＰ２等的調控［４７］。其中，萜類合成的關鍵酶基因起直接作用，而外源誘導子則逡逑可以間接地調控萜類物質的合成。逡逑１．３．１外源誘導子的調控作用逡逑細胞的信號轉導由外源誘導子信號（如病原菌，激素信號等）及與信號分子結合的逡逑受體兩部分所啟動，下游的靶基因隨之被誘導表達，并產(chǎn)生響應的次生代謝產(chǎn)物［４８］。茉逡逑

ＭＹＢ６１－Ｆ）：邋５＇－邋ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＴ－３，逡逑ＭＹＢ６１－Ｒ）：邋５’－ＴＴＡＡＧＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＧＣＣＧＣ邋－３＇逡逑和基因生物信息學分析逡逑ＥｘＰＡＳｙ、ＳＯＰＭＡ等生物信息網(wǎng)站，ＤＮＡＭＡＮ８．０生和辦基因的全長ｃＤＮＡ序列及其氨基酸理化特性等分析和預測。逡逑析逡逑／邋ｃＤＮＡ全長克隆及生物信息學分析逡逑２／基因全長的獲得逡逑錄組數(shù)據(jù)庫基因己知序列兩端設計特異引ｃＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴增后，得到的目標擴增條帶（性條帶的長度為１１１７ｂｐ，命名為辦ＧｅＭ邐１邐２逡逑
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S792.153

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王冰峰;王宏芝;魏建華;;楊樹轉錄因子PtoMYB057的功能分析[J];廣東農(nóng)業(yè)科學;2015年15期

2 項妤;劉春生;劉勇;宋曉娜;顧選;;脫落酸對甘草化學成分含量和顏色的影響[J];中國中藥雜志;2015年09期

3 李田;孫景寬;劉京濤;;植物啟動子研究進展[J];生物技術通報;2015年02期

4 田嬌;劉園;房敏峰;;外源茉莉酸類激素對藥用植物次生代謝的影響研究[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2015年01期

5 孫程;周曉今;陳茹梅;范云六;王磊;;植物JAZ蛋白的功能概述[J];生物技術通報;2014年06期

6 唐克軒;沈乾;付雪晴;顏廷祥;;植物次生代謝產(chǎn)物生物反應器研究進展[J];中國農(nóng)業(yè)科技導報;2014年01期

7 趙恒偉;葛鋒;孫穎;劉迪秋;陳朝銀;;植物萜類物質生物合成的相關轉錄因子及其應用前景[J];中草藥;2012年12期

8 郭弘光;吳繁花;;MYB轉錄因子功能與調控研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2012年20期

9 郭艷玲;張鵬英;郭默然;陳靠山;;次生代謝產(chǎn)物與植物抗病防御反應[J];植物生理學報;2012年05期

10 李春曉;尹靜;詹亞光;任春林;王智慧;;水分、氮肥及MeJA處理對白樺三萜積累特性的影響[J];西北植物學報;2012年01期

相關博士學位論文 前5條

1 陳凱利;葡萄風信子MYB和bHLH轉錄因子對花青苷合成的調控研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2017年

2 劉朝陽;甜橙CsMYBF1基因的功能鑒定和調控機理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

3 劉曉芬;MYB-bHLH-WD40對楊梅花青苷生物合成的轉錄調控機制[D];浙江大學;2013年

4 趙磊;茶樹類黃酮合成轉錄因子篩選及ANR基因功能驗證[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2013年

5 徐茂軍;一氧化氮對植物細胞次生代謝產(chǎn)物合成的調控作用及其信號轉導機理研究[D];浙江大學;2005年

相關碩士學位論文 前8條

1 張夢巖;白樺鯊烯合酶和鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及表達特性研究[D];東北林業(yè)大學;2016年

2 侯小龍;NO聯(lián)合Sa、Ja、H_2O_2通過植物次生代謝通路影響紫杉醇的合成[D];西華師范大學;2016年

3 梁甜;白樺OSC新基因的克隆、RNAi載體構建及遺傳轉化初步研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

4 包杰;MYC和Myb轉錄因子對橡膠生物合成關鍵酶轉錄調節(jié)的研究[D];海南大學;2014年

5 李春曉;MeJA和SA對白樺幼樹三萜合成調控及FPS基因克隆[D];東北林業(yè)大學;2012年

6 秦宏道;玫瑰MYB基因的克隆及超量表達載體的構建[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2011年

7 翟俏麗;真菌誘導子促進白樺懸浮細胞中三萜合成機理的初步研究[D];東北林業(yè)大學;2011年

8 蔡葛平;光周期、土壤水分及外源激素對黃芩中黃酮類成分累積的影響及其分子機制[D];復旦大學;2008年

本文編號：2623635