【摘要】：咖啡堿(1,3,7-三甲基黃嘌呤)是一種廣泛存在于自然界植物中的黃嘌呤生物堿,最常見的咖啡堿含量高的植物包括咖啡、可可和茶。黑茶渥堆過程中,多種微生物大量繁衍,微生物分泌的胞外酶構(gòu)成的生化動(dòng)力、微生物呼吸熱構(gòu)成的物化動(dòng)力及微生物體內(nèi)自身代謝造成了茶葉內(nèi)多種含物的改變,形成了黑茶獨(dú)特的風(fēng)味。不同于氨基酸、茶多酚等內(nèi)含物含量下降,咖啡堿含量呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢,這主要是微生物利用自身的代謝作用進(jìn)行了咖啡堿合成。與植物體內(nèi)的咖啡堿合成的核心途徑不同,微生物體內(nèi)可能存在一條由鳥嘌呤生成黃嘌呤最終生成咖啡堿的補(bǔ)償途徑。而鳥嘌呤作為微生物體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝物可循環(huán)積累,且微生物體內(nèi)腺嘌呤衍生物向鳥嘌呤核苷的轉(zhuǎn)化具有單向性和不可逆性,因此鳥嘌呤水解脫氨生成黃嘌呤是此條補(bǔ)償路徑中的關(guān)鍵步驟。本文嘗試對(duì)微生物體內(nèi)咖啡堿合成的補(bǔ)償途徑從理論層面和實(shí)際層面進(jìn)行驗(yàn)證,利用同位素標(biāo)記法追蹤了實(shí)際渥堆過程中咖啡堿的生成路徑,并對(duì)該補(bǔ)償途徑中關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了克隆表達(dá)、酶活檢測,HPLC法比較了不同微生物、不同啟動(dòng)子、不同表達(dá)體系對(duì)鳥嘌呤脫氨酶的酶活影響,主要取得了以下結(jié)果:(1)茶葉內(nèi)源酶在黑茶渥堆工藝之前已失活,微生物來源的外源酶成為發(fā)酵中最主要的生物催化劑的條件下,咖啡堿含量穩(wěn)定甚至有上升趨勢,黑茶渥堆中的微生物體內(nèi)存在一條鳥嘌呤生成黃嘌呤生成咖啡堿的路徑。(2)以大腸桿菌和釀酒酵母菌體為模板中分別克隆其鳥嘌呤脫氨酶基因EGUD和GUD1,構(gòu)建重組載體pMAL-GUD1和pMAL-EGUD轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),在添加鳥嘌呤為底物的情況下,發(fā)酵培養(yǎng)120 h后BL21/pMAL-GUD1和BL21/pMAL-EGUD分別合成黃嘌呤濃度為312μg/mL和267μg/mL,不添加底物的條件下,合成黃嘌呤濃度分別225μg/mL和191μg/mL。(3)構(gòu)建重組載體pRSF-GUD1轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá),含有重組載體pRSF-GUD1的菌株都比含有pMAL-GUD1的菌株對(duì)鳥嘌呤的轉(zhuǎn)化率更高。在飼喂鳥嘌呤為底物和不飼喂底物的兩種情況下,發(fā)酵120 h后重組菌株BL21/pRSF-GUD1比BL21/pMAL-GUD1的黃嘌呤合成率分別高37.5%和23.9%。表明T7啟動(dòng)子比Lac啟動(dòng)子更適合鳥嘌呤脫氨酶的表達(dá)。(4)構(gòu)建重組載體pZ8-GUD1轉(zhuǎn)入谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá),比較不同表達(dá)菌株對(duì)GUD1蛋白活性的影響。在添加底物時(shí),C.glu/pZ8-GUD1比BL21/pRSF-GUD1和BL21/pMAL-GUD1的黃嘌呤合成率分別低于44.8%和6.7%,不添加底物時(shí),分別低24.7%和6.7%。結(jié)果表明大腸桿菌比谷氨酸棒狀桿菌更適合GUD1蛋白的表達(dá),在大腸桿菌中GUD1對(duì)鳥嘌呤的轉(zhuǎn)化率更高。本文將為咖啡堿的科學(xué)研究和生產(chǎn)提供新思路,闡明黑茶渥堆發(fā)酵過程中咖啡堿上升的原因,揭示了咖啡堿合成的補(bǔ)償途徑。
【圖文】：

過程中咖啡堿前期稍有降低到后期再增長的一種趨勢；而接種青霉行渥堆發(fā)酵時(shí)，這些霉菌對(duì)咖啡堿的利用能力有限，因此發(fā)酵過程持續(xù)上升。堿的生物合成途徑生長發(fā)育中的咖啡堿合成核心途徑堿在植物中的研究主要集中在咖啡和茶樹上，，自從 19 世紀(jì) 20 利用，咖啡堿在植物中的代謝途徑的研究便從未停止[32]。后來證明，咖啡堿在各種含咖啡堿植物中合成的核心途徑是基本一心途徑主要分為四個(gè)步驟，分別是甲基化轉(zhuǎn)移酶催化的三次甲苷水解酶催化的一次脫核苷作用[34]，具體途徑為如圖 1-1 所示。嘌呤環(huán)主要來源于嘌呤核苷酸，甲基化過程中的甲基供體則來自于（SAM）。

圖 2.1 渥堆中咖啡堿生成路徑驗(yàn)證Fig2.1 Validation of the caffeine generation path in the pile-fermentin
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S571.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 邵靜娜;葛國平;何衛(wèi)中;鄭生宏;嚴(yán)芳;繆葉e

本文編號(hào)：2623507