【摘要】：芥藍(Brassica oleracea var.alboglabra)是十字花科蕓薹屬蔬菜,以肥嫩的花薹及嫩葉為主要食用器官。由于其含有豐富的維生素C、類胡蘿卜素、芥子油苷和多酚等多種營養(yǎng)物質(zhì),而深受消費者的喜愛和歡迎。八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturase,PDS)是類胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶之一。試驗前期我們發(fā)現(xiàn)在芥藍中PDS基因有兩個成員,但兩個成員各自的功能及相互關(guān)系尚不清楚。因此,本研究以白花芥藍為試驗材料,通過時空表達、啟動子順式元件分析結(jié)果選擇光和激素處理芥藍幼苗、亞細(xì)胞定位、CRISPR敲除突變體表型,對BaPDSs基因家族兩個成員的功能差異進行了系統(tǒng)分析,研究結(jié)果為提高芥藍中類胡蘿卜素含量和改善芥藍營養(yǎng)品質(zhì)提供理論依據(jù)。本研究主要結(jié)果如下:1、通過同源序列檢索分析設(shè)計特異性引物,采用反轉(zhuǎn)錄PCR方法成功分離出芥藍PDS基因家族的兩個成員,并命名為BaPDS1和BaPDS2,NCBI登錄號分別為KX426039和KX426040。這兩個基因的CDS區(qū)長度及其編碼的氨基酸數(shù)分別為1692bp、563個和1698 bp、565個。根據(jù)同源性分析和構(gòu)建的進化樹,表明BaPDSs蛋白與十字花科的甘藍、亞麻芥、白菜、擬南芥等植物的親緣關(guān)系較近,同時發(fā)現(xiàn)在進化過程中PDS蛋白較保守。2、對芥藍進行時空表達分析,發(fā)現(xiàn)BaPDS1和BaPDS2基因表達水平在芥藍不同發(fā)育時期和組織器官間均存在顯著差異。萌動種子期BaPDSs表達量較低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官間呈現(xiàn)組成型表達,BaPDS2在器官間表達差異較大,幼果中未檢出;花器官中萼片的BaPDSs表達量顯著低于其他組織,在開花過程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表達水平出現(xiàn)上調(diào)。3、分離獲得BaPDS1和BaPDS2啟動子序列,分別進行順式作用元件分析,統(tǒng)計兩者相同和差異的順式元件,并根據(jù)預(yù)測結(jié)果選擇光和激素對芥藍幼苗進行三種不同處理。結(jié)果表明,不同光質(zhì)處理下,BaPDS1對藍光和紅藍光有響應(yīng),藍光促進BaPDS1表達,3 h為峰值,后期表達量下降,紅藍光照射下BaPDS1表達量明顯高于對照,BaPDS2只對藍光有響應(yīng),但藍光抑制其表達。不同光強處理下,強光可誘導(dǎo)BaPDS1的表達量增加,且在24 h出現(xiàn)峰值,弱光誘導(dǎo)BaPDS2的表達量增加,在12 h時出現(xiàn)峰值,黑暗抑制了BaPDS2表達,且表達量隨時間變化逐漸趨向于0。不同激素處理下,BaPDS1和BaPDS2共同響應(yīng)SA、ABA和MeJA,此外,BaPDS2還響應(yīng)GA_3。在ABA處理下,BaPDS1和BaPDS2表達量都呈先下降后上升趨勢,且后期表達量明顯高于對照;SA處理下,BaPDS1和BaPDS2表達量都顯著低于對照;GA_3處理下,BaPDS1表達量與對照無明顯差異,而BaPDS2表達量在1 h時出現(xiàn)峰值,1 h后表達量基本上都低于對照;MeJA處理下,BaPDS1表達量基本低于對照,而BaPDS2表達量明顯高于對照,除12 h外。4、構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體pC2300-35S-BaPDS1-eGPF和pC2300-35S-BaPDS2-eGPF,并將其分別轉(zhuǎn)至芥藍原生質(zhì)體中。經(jīng)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),BaPDS1和BaPDS2均定位于葉綠體上,與預(yù)測結(jié)果一致。5、選擇BaPDS1和BaPDS2基因的共同靶位點,構(gòu)建CRISPR/Cas9載體(pCC-Target-sgRNA),轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌浸染芥藍帶柄子葉,獲得純合型轉(zhuǎn)基因雙突變和單突變植株,通過對植株表型的觀察及色差測定發(fā)現(xiàn),無論單突還是雙突突變體,植株均表現(xiàn)出白化表型,但BaPDS1和BaPDS2雙突變的植株白化現(xiàn)象更為明顯,表明BaPDS1、BaPDS2兩個基因?qū)嫠{的生長發(fā)育是同等重要的,缺少任何一個都會阻礙類胡蘿卜素和葉綠素的正常合成,導(dǎo)致植物的生長發(fā)育受阻,最終致使植株白化致死。結(jié)果表明BaPDS1和BaPDS2基因在芥藍類胡蘿卜素合成中分別發(fā)揮不同的作用,但兩者功能還存在部分互補的關(guān)系。
【圖文】：

6圖 2 植物中類胡蘿卜素脫氫反應(yīng)[35]Fig. 2 Carotene desaturation in plants植物中，PDS 基因是由 Pecker 等在 1992 年從組囊藻突變體中最早分離得到5 年，Kumagai 等在野生本氏煙草中進行 PDS 基因的反義表達，發(fā)現(xiàn)大量的紅素在轉(zhuǎn)基因煙草的葉片中累積[37]；2000 年，Romer 等在番茄中轉(zhuǎn)入 PDS 基發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因番茄的果實中 β-胡蘿卜素的含量顯著高于對照組，約占總類含量的一半[38]；2009 年，高新征等研究發(fā)現(xiàn)，在番木瓜果實的成熟過程中達量隨之增加，同時發(fā)現(xiàn)在不同顏色的果肉中其表達量有明顯差異，其中紅于黃肉[39]；2013 年，朱海生等以植物表達載體 pBI121 為基礎(chǔ)，成功組建了 pBI2A2APSY-PDS-ZDS，為后續(xù)提高草莓體內(nèi)類胡蘿卜素含量奠定基礎(chǔ)[40，，PDS 常被作為報告基因，建立試驗體系。

芥藍葉片總RNAFig.3TotalRNAofextractedfromChinesekale
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S635.9

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1 薛生玲;芥藍八氫番茄紅素脫氫酶基因BaPDS1和BaPDS2功能差異分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號：2617598