【摘要】：三疣梭子蟹是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖蟹類(lèi),池塘養(yǎng)殖三疣梭子蟹卵巢發(fā)育不良是困擾該產(chǎn)業(yè)的重要問(wèn)題。雌二醇是甲殼動(dòng)物體內(nèi)十分重要的性類(lèi)固醇激素,在卵巢發(fā)育過(guò)程中起到十分重要的作用。盡管池塘養(yǎng)殖三疣梭子蟹卵巢發(fā)育不良可能與雌二醇(E_2)分泌不足有關(guān),但有關(guān)于其作用機(jī)制所知甚少。本研究首先采用免疫熒光的方法研究了三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中E_2在卵巢、肝胰腺、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)和大顎器中的分布及變化規(guī)律;此后,通過(guò)離體和活體實(shí)驗(yàn)研究了E_2對(duì)三疣梭子蟹卵巢發(fā)育、卵黃蛋白原(Vg)和雌激素相關(guān)受體(ERR)基因表達(dá)的影響;最后通過(guò)RNAi實(shí)驗(yàn)初步探討了ERR基因在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中可能作用。具體研究結(jié)果如下:1.三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中E_2的免疫定位本研究采用免疫組化的方法系統(tǒng)研究了卵巢發(fā)育過(guò)程中E_2在卵巢、肝胰腺、胸神經(jīng)節(jié)、腦神經(jīng)節(jié)和大顎器中的分布及變化。結(jié)果表明:(1)卵巢中E_2的免疫陽(yáng)性主要分布于濾泡細(xì)胞和卵巢發(fā)育中后期的卵母細(xì)胞胞質(zhì)(II-V期),隨著卵巢的發(fā)育,卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的E_2免疫陽(yáng)性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),而濾泡細(xì)胞中則一直存在較強(qiáng)的E_2免疫陽(yáng)性;(2)在肝胰腺(I-IV期)中,E_2的免疫陽(yáng)性主要分布于F細(xì)胞及R細(xì)胞核中,其最大免疫陽(yáng)性出現(xiàn)在卵巢發(fā)育IV期的肝胰腺中;(3)在神經(jīng)組織(I-IV期)中,E_2主要分布于胸神經(jīng)團(tuán)的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)髓質(zhì)以及腦神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的胞核內(nèi),并始終保持著強(qiáng)免疫陽(yáng)性反應(yīng);(4)在大顎器(I-IV期)中,E_2強(qiáng)免疫陽(yáng)性始終存在于大顎器腺細(xì)胞的核仁以及核周?chē)募?xì)胞質(zhì)內(nèi)。以上結(jié)果暗示,卵巢、肝胰腺、胸神經(jīng)團(tuán)、腦神經(jīng)節(jié)和大顎器可能是三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中E_2的主要作用靶點(diǎn),不同靶器官間可能存在復(fù)雜的相互作用來(lái)共同調(diào)控卵巢發(fā)育。2.E_2對(duì)三疣梭子蟹卵巢發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響通過(guò)活體注射和離體調(diào)控兩種手段來(lái)研究E_2對(duì)三疣梭子蟹卵巢發(fā)育、ERR和Vg基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明:(1)對(duì)處于卵巢發(fā)育III期中期的三疣梭子蟹而言,不同濃度的外源E_2活體注射,對(duì)其卵巢指數(shù)和肝胰腺指數(shù)無(wú)顯著影響;(2)注射不同濃度的外源E_2對(duì)卵巢和肝胰腺中ERR和Vg mRNA的表達(dá)量有顯著影響,主要表現(xiàn)為不同濃度的外源E_2可促進(jìn)卵巢和肝胰腺中Vg-mRNA的表達(dá)量顯著升高,而ERR-mRNA的表達(dá)量則顯著下降;(3)在神經(jīng)組織和大顎器中,不同濃度的外源E_2均會(huì)降低ERR的表達(dá)量,推測(cè)E_2是通過(guò)調(diào)節(jié)ERR和Vg兩種基因的拮抗表達(dá)來(lái)調(diào)控卵巢發(fā)育;(4)取卵巢發(fā)育處于III期的三疣梭子蟹的卵巢進(jìn)行離體調(diào)控實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明10-8mol/L E_2可以顯著提高卵巢中ERR-mRNA的表達(dá)水平。3.離體條件下三疣梭子蟹ERR RNA干擾體系的建立及其功能的初探首先通過(guò)體外逆轉(zhuǎn)錄合成3個(gè)不同的ERR dsRNA干擾片段,在26°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),取III期卵巢離體干擾1h、2h、4h、8h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一條干擾片段持續(xù)有效,干擾片段的濃度為2μg/ml。此后,對(duì)卵巢發(fā)育處于III期的卵巢組織進(jìn)行4種不同處理的離體培養(yǎng),分別為:2μg GFP dsRNA(A組)、2μg ERR dsRNA(B組)、2μg ERR dsRNA和10-8mol/L的E_2聯(lián)用組(C組)及10-8mol/L E_2組(D組),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與A組相比,B組和C組中ERR基因的表達(dá)量顯著下降,而D組ERR基因的表達(dá)量顯著升高。這說(shuō)明在本研究中篩選的ERR dsRNA可有效降低卵巢中ERR-mRNA的表達(dá)水平,10-8mol/L E_2可以顯著提高卵巢中ERR-mRNA的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明ERR在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育的調(diào)控過(guò)程中起到十分重要的作用,E_2可能是通過(guò)作用于ERR的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控卵黃發(fā)生,相關(guān)調(diào)控路徑還需要進(jìn)一步深入研究。
【圖文】：

圖1-2 ERα和ERβ 結(jié)構(gòu) 意圖(Muramatsu and Inoue, 2000; Tong et al, 2002).3.2 雌激素膜受體1977 年，Pietras 等發(fā)現(xiàn)給予刺激后細(xì)胞內(nèi)的基因水平將會(huì)迅速上調(diào)，因此可能存在膜性 ER(membrane estrogen receptor, mER)。隨后，很多學(xué)者運(yùn)用抗體結(jié)合、激光共聚焦等手段均證實(shí)了膜性 ER 的存在，并且發(fā)現(xiàn)雌激素膜受占 2%~3% (Pappas et al, 1995; Razandi et al, 1999)。核受體類(lèi)似型膜受體可能核受體在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中具有不同的剪切方式所造成的也可能是由核受體變異而的。mGPER1 是真正的 mER，mGPER1 與配體結(jié)合時(shí)均具有 mER 的特性，，，其他檢測(cè)方法也提示其主要位于細(xì)胞膜上(Gobeil et al, 2006)。.3.3 雌激素的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑非常復(fù)雜。主要的雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑有兩種即：基因組途徑和非基因組途徑(圖 1-3)。

圖1-2 ERα和ERβ 結(jié)構(gòu) 意圖(Muramatsu and Inoue, 2000; Tong et al, 2002)1.3.2 雌激素膜受體1977 年，Pietras 等發(fā)現(xiàn)給予刺激后細(xì)胞內(nèi)的基因水平將會(huì)迅速上調(diào)，因此推測(cè)可能存在膜性 ER(membrane estrogen receptor, mER)。隨后，很多學(xué)者運(yùn)用抗原抗體結(jié)合、激光共聚焦等手段均證實(shí)了膜性 ER 的存在，并且發(fā)現(xiàn)雌激素膜受體只占 2%~3% (Pappas et al, 1995; Razandi et al, 1999)。核受體類(lèi)似型膜受體可能是由核受體在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中具有不同的剪切方式所造成的也可能是由核受體變異而形成的。mGPER1 是真正的 mER，mGPER1 與配體結(jié)合時(shí)均具有 mER 的特性，同時(shí)，其他檢測(cè)方法也提示其主要位于細(xì)胞膜上(Gobeil et al, 2006)。1.3.3 雌激素的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑非常復(fù)雜。主要的雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑主要有兩種即：基因組途徑和非基因組途徑(圖 1-3)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

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