【摘要】：樺褐孔菌Inonotus obliquus或Fuscoporia obliqua是一種非常珍貴的多孔菌科褐臥孔菌屬藥用真菌,其主要寄生在白樺樹(shù)等樹(shù)皮或者樹(shù)干下,子實(shí)體呈現(xiàn)不規(guī)則的黑色瘤狀。其主要分布在北半球高緯度寒冷地區(qū),如波蘭、芬蘭、俄羅斯,以及中國(guó)的黑龍江,吉林等地。樺褐孔菌具有多種藥理活性,如抗癌、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等。黑色素的生物合成是真菌抵御環(huán)境脅迫的重要生存策略,真菌通過(guò)DHN和DOPA途徑合成黑色素,但樺褐孔菌水溶性黑色素的合成不受這兩個(gè)途徑的專(zhuān)化性抑制劑熊果苷或三環(huán)唑抑制。前期研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌一雜合的非核糖體肽合成酶-聚酮合成酶基因(nrps-pks)表達(dá)產(chǎn)物與其水溶性黑色素相似,且該基因與蛋白激酶、二肽酶及溶血素共調(diào)蛋白等10個(gè)基因形成NPM(非核糖體肽聚酮)基因簇。為了研究樺褐孔菌NPM基因簇的相關(guān)功能,本文將在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上展開(kāi)以下研究:1.以構(gòu)巢曲霉分子遺傳操作體系為基礎(chǔ),以同源重組和融合PCR技術(shù)為手段,構(gòu)建構(gòu)巢曲霉NPM基因簇表達(dá)菌株。2.以釀酒酵母異源表達(dá)體系為基礎(chǔ),以質(zhì)粒重組技術(shù)為手段,構(gòu)建釀酒酵母nrps-pks分段表達(dá)菌株。3.以乳酸乳球菌NICE蛋白表達(dá)體系為基礎(chǔ),以質(zhì)粒重組技術(shù)為手段,構(gòu)建乳酸乳球菌HCP基因表達(dá)菌株。4.以構(gòu)巢曲霉wA位點(diǎn)轉(zhuǎn)入nrps-pks基因及NPM基因簇的菌株為基礎(chǔ),以四種不同氨基酸做底物,研究其表型變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)十次的分段轉(zhuǎn)化成功將樺褐孔菌NPM基因簇完整轉(zhuǎn)入構(gòu)巢曲霉wA位點(diǎn);以質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建的nrps-GST-pXW55載體和nrps-pksGST-pXW55載體在釀酒酵母中得到了成功表達(dá);以質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建的HCPpNZ8148在乳酸乳球菌中得到了成功的表達(dá);經(jīng)過(guò)四種氨基酸做底物,培養(yǎng)基中菌株均出現(xiàn)了不同程度的表型變化,尤其是以苯丙氨酸,色氨酸和異亮氨酸做底物時(shí)表型變化最為明顯。結(jié)果顯示NRPS-PKS最優(yōu)先選擇異亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸為底物,具有底物特異性。本研究雖以樺褐孔菌NPM基因簇及相關(guān)基因異源表達(dá)菌株的構(gòu)建為基礎(chǔ),但這將為后續(xù)nrps-pks表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單元、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及NPM基因簇中與nrps-pks轉(zhuǎn)錄激活、表達(dá)產(chǎn)物結(jié)飾以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的基因功能研究提供必須材料,進(jìn)而為開(kāi)展樺褐孔菌黑色素合成新途徑的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 DHN（a）和 DOPA（b）黑色素的結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Structure of DHN（a）and DOPA（b） 1-2 DOPA（A）和 DHN（B）黑色素的合成途The way of DOPA（A）and DHN（B）melanin合成的生物學(xué)意義菌生物體賴(lài)以生存的必需物質(zhì)，但是其

圖 1-2 DOPA（A）和 DHN（B）黑色素的合成途徑Fig.1-2 The way of DOPA（A）and DHN（B）melanin synthesis菌黑色素生物合成的生物學(xué)意義色素雖然不是真菌生物體賴(lài)以生存的必需物質(zhì)，但是其獨(dú)特的生理功能的生活史中產(chǎn)生著巨大的作用。比如黑色素可以顯著增強(qiáng)真菌生物體在環(huán)境中存活能力和競(jìng)爭(zhēng)能力，是真菌在高溫、寒冷、高鹽、高輻射、干旱件下的重要保護(hù)傘。與此同時(shí)，真菌致病性的強(qiáng)弱也是和黑色素的合成有聯(lián)系[8]。然而近些年以來(lái)，真菌黑色素的抗輻射和抗腫瘤作用是整個(gè)科學(xué)熱點(diǎn)。如在長(zhǎng)期受到核輻射地區(qū)發(fā)現(xiàn)了可以大量繁殖的黑色真菌[9]，它們能力很強(qiáng)。此外也有發(fā)現(xiàn)表明，，受紫外線(xiàn)輻射較為強(qiáng)烈的地區(qū)黑曲霉孢子的含量遠(yuǎn)高于未受紫外線(xiàn)輻射的黑曲霉[10]。這些發(fā)現(xiàn)均說(shuō)明了真菌黑色
【學(xué)位授予單位】：江蘇師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S567.3

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本文編號(hào)：2608963