【摘要】：蛋白質的泛素化是一種可逆的翻譯后修飾,參與了細胞內一系列生理反應,包括蛋白質降解、細胞信號轉導、表觀遺傳修飾、細胞定位等,并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。去泛素化酶(DUBs)是泛素化修飾的負向調節(jié)因子,理解去泛素化酶的功能和作用機制是目前的研究熱點。目前已知的去泛素化酶主要包括UBP/USP家族、UCH家族、OTU家族、JAMM家族、MJD家族和MCPIP家族。其中,OTU家族作為去泛素化酶中的第二大家族,在DNA損傷修復、炎癥免疫應答、代謝穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多個方面發(fā)揮著重要的功能。目前人源OTU家族共發(fā)現(xiàn)16個具有去泛素化酶催化活性的成員,主要可分為Otubains、A20-like OTUs和OTUDs三個亞家族,該家族成員主要通過高度保守的OTU結構域行使其去泛素化酶的催化活性,且該家族成員對底物的去泛素化修飾具有鏈型特異性。OTUD4是OTUDs亞家族中的一個成員,目前已報道的去泛素化酶OTUD4修飾的底物泛素鏈類型有K48型泛素鏈和K63型泛素鏈。其中,OTUD4可通過自身第202位和204位絲氨酸的磷酸化來激活其去泛素化酶活性,從而去除TLR信號通路關鍵接頭蛋白MyD88的K63型泛素鏈,進而實現(xiàn)對先天免疫的穩(wěn)態(tài)調節(jié)。此外,OTUD4還可以酶活非依賴的方式調節(jié)DNA去甲基化酶ALKBH2和ALKBH3的蛋白穩(wěn)定性,進而促進DNA的烷基化損傷修復。有研究發(fā)現(xiàn)伴隨有共濟失調和低促性腺素癥患者體內Otud4基因存在非酶活突變,Otud4基因突變是否是導致這一綜合癥的主要原因及其調控這一綜合癥的功能機制是什么仍然未知。為了深入探究OTUD4的生理功能,我們通過Cre-Loxp策略構建了去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型,并對該小鼠模型進行了初步的表型分析。我們目前的研究結論主要有:1.Otud4基因敲除后,Otud4~(-/-)小鼠能夠正常出生和存活,并且其出生率符合孟德爾遺傳規(guī)律;此外,與同窩Otud4~(+/+)小鼠相比,Otud4~(-/-)小鼠在體型、體重等方面均沒有顯著性差異;2.通過解剖發(fā)現(xiàn),與同窩Otud4~(+/+)小鼠相比,Otud4~(-/-)小鼠的大腦、小腦、胸腺、肺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟在重量上均沒有統(tǒng)計學差異;3.小鼠組織病理學分析發(fā)現(xiàn),Otud4~(-/-)小鼠的大腦、小腦、肺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟并無明顯的病理學異常;4.對同窩Otud4~(+/+)小鼠和Otud4~(-/-)小鼠進行血象分析和血糖監(jiān)測發(fā)現(xiàn),Otud4~(-/-)小鼠的血象和血糖也均正常。OTUD4究竟具有哪些生理功能,我們仍然還需探索。綜上所述,我們采用Cre-Loxp策略首次構建了去泛素化酶OTUD4的基因敲除小鼠模型并對其表型進行了初步分析。我們的研究發(fā)現(xiàn),Otud4基因敲除后,Otud4~(-/-)小鼠能夠正常出生和存活,并且主要組織器官并沒有明顯病理學異常,小鼠血液中的成分和血糖濃度也均正常。Otud4基因敲除小鼠模型的成功構建為進一步探究去泛素化酶OTUD4的生理功能奠定了基礎。巨噬細胞是機體內重要的免疫細胞,其分布于全身的各個組織中,在機體的免疫反應中發(fā)揮著重要的功能。巨噬細胞具有較強的異質性和可塑性,即巨噬細胞在不同的組織中具有不同的形態(tài)和功能,在不同的刺激條件下,巨噬細胞的表型也存在差異。通常,人們將巨噬細胞按功能劃分為經典激活的巨噬細胞(M1型巨噬細胞)和非經典激活的巨噬細胞(M2型巨噬細胞)。在炎癥反應過程中,M1型巨噬細胞通常被促炎細胞因子IFN-γ或其他微生物產物(如LPS)激活,從而呈現(xiàn)促炎表型,而M2型巨噬細胞通常被抑炎細胞因子如IL-4、IL-13、IL-10以及TGF-β激活,從而呈現(xiàn)抑炎表型。M1型和M2型是巨噬細胞極化的兩個極端。巨噬細胞極化的激活和失活在免疫和炎癥反應中發(fā)揮著重要的功能,目前有關調控巨噬細胞極化的分子機制研究還很有限,因此,鑒定更多調控巨噬細胞極化的分子對于更好了解巨噬細胞功能的發(fā)揮具有重要意義。CKIP-1是一個含PH結構域、與細胞骨架相關的蛋白,其參與調節(jié)細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等眾多生物學過程。我們的研究發(fā)現(xiàn)CKIP-1是調控巨噬細胞極化的一個分子開關,其受M1和M2極化經典刺激信號的調節(jié),并且反過來可以通過負反饋回路同時調節(jié)M1和M2型巨噬細胞極化。首先,我們通過篩選發(fā)現(xiàn)CKIP-1在小鼠骨髓來源的巨噬細胞BMDM和腹腔巨噬細胞PM中均高表達;其次,我們發(fā)現(xiàn)在促炎M1刺激物(如LPS和IFN-γ)誘導下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表達增加,而在抑炎M2刺激物(如IL-4和IL-13)誘導下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表達下調。此外,在生理上,我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞特異性CKIP-1缺失對抑制體內TPA誘導的皮膚炎癥是不可或缺的。以上研究表明,CKIP-1是一種新的調控巨噬細胞極化的關鍵分子。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q75

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