【摘要】：大熊貓(學(xué)名:Ailuropoda melanoleuca),又被人稱為“活化石”,是一種只發(fā)現(xiàn)于中國(guó)的珍貴物種,它的分布范圍包括四川西北、陜西西南、西藏東部和甘肅南部。喜食箭竹,也愛吃蜂蜜。其極低的繁殖率,導(dǎo)致個(gè)體數(shù)量少,我國(guó)把它列為一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。四川黑熊(學(xué)名:Ursus thibetanus mupinensis),名字還包括月熊、藏熊等,它采食的食物種類多樣,喜歡吃幼嫩葉子和真菌。亞洲南部溫暖地區(qū)是它的活動(dòng)地帶,因?yàn)槿祟惖倪^(guò)度捕獵行為,我國(guó)把它確定為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物,同時(shí)納入中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書。綜合來(lái)看兩個(gè)物種都有特別的研究?jī)r(jià)值。本研究根據(jù)人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos Taurus)、黑猩猩(Pan troglodytes)五種哺乳動(dòng)物物種已知的mRNA序列為參考來(lái)設(shè)計(jì)引物;實(shí)驗(yàn)材料是大熊貓和四川黑熊骨骼肌,再分別從材料中提取出總RNA和基因組DNA;然后采用反轉(zhuǎn)錄PCR、降落PCR(Touch-down PCR)技術(shù)分別進(jìn)行兩個(gè)物種BANF1的表達(dá)序列和結(jié)構(gòu)基因序列的擴(kuò)增與克隆;把產(chǎn)物外送測(cè)序,并使用分析軟件對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行比較、分析;分別構(gòu)建了大熊貓和四川黑熊的BANF1cDNA的重組表達(dá)載體,然后將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli-BL21,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)給其他與大熊貓和四川黑熊的基因相關(guān)的研究提供了具體的方法和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:從大熊貓和四川黑熊克隆得到的BANF1的cDNA序列有297個(gè)堿基,含有一個(gè)270 bp編碼89個(gè)氨基酸的開放閱讀框。大熊貓基因組序列長(zhǎng)度為521 bp,四川黑熊為536 bp,都擁有2個(gè)外顯子。經(jīng)過(guò)軟件分析得出,BANF1基因的核苷酸序列、氨基酸序列的保守性比較高,這一點(diǎn)有一定的借鑒意義。將大熊貓分別與四川黑熊、人、小家鼠、褐家鼠、牛和黑猩猩6個(gè)物種的BANF1基因的編碼序列及其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行相似性比較,結(jié)果顯示編碼序列相似性分別為98.15%,96.6%,93.3%,93.03%,96.6%和96.6%;而氨基酸序列的相似性分別為96.63%,93.7%,92.6%,91.5%,91.1%和93.7%。把四川黑熊分別與人、小家鼠、褐家鼠、牛和黑猩猩5個(gè)物種的BANF1基因的編碼序列及其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行相似性比較,結(jié)果顯示編碼序列相似性分別為95.19%,94.10%,93.33%,92.96%和95.56%;而氨基酸序列的相似性分別為100%,96.63%,96.63%,100%和100%。拓?fù)漕A(yù)測(cè)顯示大熊貓和四川黑熊的BANF1蛋白同時(shí)含有一個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),一個(gè)酰胺化位點(diǎn),一個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn),一個(gè)N-肉豆蔻�；稽c(diǎn);此外,大熊貓獨(dú)有一個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)。使用感受態(tài)細(xì)胞BL21進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明,BANF1蛋白含有N-末端His-標(biāo)記的預(yù)期的14 kDa的多肽,累積于包涵體內(nèi)。目的蛋白經(jīng)過(guò)分離純化后,可以用于其他實(shí)驗(yàn)安排。
【圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果、分析與討論第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果、分析與討論3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1 總 RNA 和基因組 DNA 的提取結(jié)果（圖 3-1）使用濃度為 1.0%的 Agarose 進(jìn)行電泳檢測(cè)總 RNA，用 0.6%的 Agarose 進(jìn)因組 DNA 提取檢測(cè)，圖 3-1（a）所示，28S RNA 條帶的亮度約為 18S RNA 條亮度的兩倍，表明總 RNA 質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；3-1（b）圖所示，組 DNA 沒(méi)有明顯降解跡象，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 3-1（a）所示，28S RNA 條帶的亮度倍，表明總 RNA 質(zhì)量較好，，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；3-有明顯降解跡象，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖 3-1 總 RNA(a)和 DNA（b）提取電泳圖Fig. 3-1 Results of total RNAs (a) and DNA (b) extraANF1 cDNA RT-PCR 和結(jié)構(gòu)基因 PCR 結(jié)果（圖 3-2 ）
【學(xué)位授予單位】：西華師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q953

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本文編號(hào)：2577540