【摘要】：油菜屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica),是我國重要的油料作物之一。隨著國際競爭日趨激烈,我國油菜生產(chǎn)還面臨許多挑戰(zhàn),高含油率油菜種植資源尤為稀缺。長調(diào)節(jié)因子生(growth-regulating factor,GRF)作為一種轉(zhuǎn)錄因子對植物生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究證明,油菜生長調(diào)節(jié)因子BnGRF2可提高轉(zhuǎn)化的擬南芥種子含油量,同時增加粒重,但BnGRF2調(diào)控油菜的研究尚未見報道。此外,雜草危害是限制油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因子之一,伴隨著我國農(nóng)村勞動力的日益緊缺,靠人工除草已不能滿足油菜生產(chǎn)的需求,并且增加了生產(chǎn)成本。因此,本研究通過轉(zhuǎn)基因手段將BnGRF2和草甘膦抗性基因EPSPs應(yīng)用于油菜,對于確定BnGRF2在油菜種子發(fā)育和油脂合成中的作用、雙價基因?qū)τ筒松L的影響具有一定的理論意義,也為同時獲得提高種子含油量和具有除草劑抗性的新型油菜種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。本文以甘藍型油菜品種“青雜5號”恢復(fù)系“1831R”(簡稱QZ-1831R)和白菜型油菜品種H165的下胚軸和葉片為研究對象,設(shè)置不同濃度的6-BA和2,4-D,6-BA和GA3的正交試驗,從中選擇出適于甘藍型油菜和白菜型油菜下胚軸與葉片誘導(dǎo)愈傷和芽再生培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上,以8個品種(系)為試驗材料,研究不同基因型對再生體系的影響。以篩選出的較優(yōu)4種基因型為研究對象,設(shè)計5個NAA/IAA的濃度梯度,選擇適于甘藍型和白菜型油菜生根的NAA/IAA濃度。此外,本研究在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基礎(chǔ)上,探究不同時間處理的超聲波法和不同真空滲透壓力真空滲透法對轉(zhuǎn)化的影響。同時,本研究使用了最適于轉(zhuǎn)化過程中脫除農(nóng)桿菌的不同濃度梯度的四種抗生素(羧芐青霉素(Carb)、阿莫西林(Cav)、頭孢霉素(Cef)、特美汀(Tim))。取得的主要結(jié)果如下:1.油菜高頻再生體系影響要素的探究(1)最適于QZ-1831R下胚軸和葉片的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA的濃度為2 mg·L~(-1),2,4-D的濃度為0.5 mg·L~(-1);最適于H165下胚軸和葉片的愈傷誘導(dǎo)中6-BA的濃度為2 mg·L~(-1),2,4-D的濃度為1.0 mg·L~(-1)。最佳的芽再生培養(yǎng)基中6-BA的濃度均為4 mg·L~(-1),GA3均的濃度為1.5 mg·L~(-1)。因此,可在甘藍型油菜的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2 mg·L~(-1) 6-BA,0.5 mg·L~(-1)2,4-D;在白菜型油菜的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2 mg·L~(-1) 6-BA,1.5 mg·L~(-1) 2,4-D;在芽再生培養(yǎng)基中可加入4 mg·L~(-1) 6-BA,1.5 mg·L~(-1) GA3。(2)不同的基因型對植株再生的影響不一。下胚軸愈傷誘導(dǎo)率由高到底依次為QZ-1831RH165LY-C20QZ-482RGZ-3219RH403-3H403-2;葉片愈傷誘導(dǎo)率依次為GZ-3219RH403-3QZ-1831R≥QZ-482RLY-C20≥H165H403-2。芽再生中,甘藍型油菜品種的下胚軸及葉片的芽再生率均高于白菜型。表明基因型對油菜再生能力有很大影響,同時甘藍型油菜中表現(xiàn)最好的為QZ-1831R和GZ-3219R,白菜型油菜中表現(xiàn)最好的為H165和H403-3。(3)最適于QZ-1831R、GZ-3219R的最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L~(-1) NAA(0.4mg·L~(-1) IAA);H165、H403-3的最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg·L~(-1)(NAA/IAA)。說明甘藍型油菜較白菜型油菜易生根。2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(1)對農(nóng)桿菌介導(dǎo)和超聲波或真空滲透轉(zhuǎn)化法以及抗生素脫菌效果進行了研究,結(jié)果表明超聲波處理15 s為宜;真空滲透壓力為0.05 Mpa,時間為2 min時,下胚軸及葉片的轉(zhuǎn)化效率明顯優(yōu)于其它處理;抗生素濃度在500-600 mg·L~(-1)下,均可有效抑制農(nóng)桿菌的生長,抗生素濃度低于500 mg·L~(-1)時,Carb抑菌效果最好,但是芽再生階段300 mg·L~(-1)的Cav處理下芽再生能力最強。(2)經(jīng)草甘膦抗性篩選及PCR初步檢測,甘藍型油菜中QZ-1831R的下胚軸和葉片轉(zhuǎn)化率最高,分別為4.83%、4.98%;白菜型油菜品種中H403-2的下胚軸及葉片轉(zhuǎn)化率最高,分別為4.4%、4.2%。(3)對轉(zhuǎn)基因油菜T1代植株進行qRT-PCR檢測分析,結(jié)果表明:除QZ-1831R外,其余6個品種中BnGRF2表達量顯著高于對照植株。研究BnGRF2對7個轉(zhuǎn)基因品種含油量和千粒重的影響,發(fā)現(xiàn)除QZ-1831R外,甘藍型品種GZ-3219R、QZ-482R、LY-C20,白菜型品種H165、H403-2、H403-3的含油量和千粒重顯著高于WT。
【圖文】：

32由圖 2A 所示，不同濃度和配比的 6-BA，2,4-D 對誘導(dǎo)甘藍型和白菜型油菜的生愈傷的能力不同。對 QZ-1831R，當 6-BA 濃度為 1 mg L-1時，隨著 2,4-D 濃度的增加愈傷誘導(dǎo)率6-BA 濃度為 2 mg L-1時，隨著 2,4-D 濃度的增加愈傷誘導(dǎo)率先遞增后降低；當 6-B3 mg L-1時，隨著 2,4-D 濃度的增加愈傷誘導(dǎo)率趨于穩(wěn)定但低于 2 mg L-16-BA 的處濃度配比為 2 mg L-16-BA+0.5 mg L-12,4-D 時，與其它處理下的愈傷誘導(dǎo)結(jié)果差異傷誘導(dǎo)率達到 96.7%，其次為 2 mg L-16-BA+1.0 mg L-12,4-D 處理、3 mg L-16-BA+2,4-D 處理，愈傷誘導(dǎo)率依次高出 4.8%、16.0%。說明 6-BA，2,4-D 濃度都較低時誘導(dǎo)效果不明顯，最佳激素組合為 2 mg L-16-BA+0.5 mg L-12,4-D。對 H165，當 6-BA 濃度為 1 mg L-1時，，隨著 2,4-D 濃度的增加愈傷誘導(dǎo)率遞增濃度為 2 mg L-1時，隨著 2,4-D 濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率無明顯變化；當 6-BA 濃度為

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017 屆碩士畢業(yè)論文hghfgfedcbb baabbbbihggfedcdbcbabcde eee0.0%10.0%20.0%30.0%40.0%50.0%60.0%70.0%再生率（芽%）Shootergenearitonaret不同植物激素組合對下胚軸芽再生的影響Effects of different phytohormone combinations on Hypocotyl regeneration1831R H165A
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S565.4

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本文編號：2556965