【摘要】：【目的】研究新疆紅肉蘋果雜種一代優(yōu)系‘紅脆1號(hào)’液泡膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdVGT1生物學(xué)信息、表達(dá)水平及其在糖代謝中的功能,旨在為進(jìn)一步完善功能型蘋果育種的理論與技術(shù)體系提供參考�！痉椒ā恳孕陆t肉蘋果雜種一代優(yōu)系‘紅脆1號(hào)’為試材,克隆MdVGT1,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;并采用熒光定量PCR分析該基因在不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá),分析‘嘎啦’組培苗中該基因在葡萄糖誘導(dǎo)下的表達(dá),通過(guò)酵母雙雜交驗(yàn)證其互作關(guān)系,并通過(guò)原核誘導(dǎo)獲得重組蛋白。【結(jié)果】在‘紅脆1號(hào)’中克隆獲得MdVGT1全長(zhǎng),測(cè)序發(fā)現(xiàn)其包含1 506 bp完整的開(kāi)放閱讀框,編碼501個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)分子量為53.16 kD,等電點(diǎn)為5.92,定位于蘋果基因組的1號(hào)染色體上,由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成;糖代謝相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,MdVGT1與AtVGT1、VvVGT1、CsVGT1在同一個(gè)進(jìn)化枝上,功能域分析表明,MdVGT1蛋白含有12個(gè)跨膜區(qū)域;MdVGT1在蘋果的花、葉和幼果中均有較高的表達(dá),在果實(shí)發(fā)育中,其表達(dá)量與葡萄糖含量有顯著的相關(guān)性;MdVGT1啟動(dòng)子含有與抗逆、糖信號(hào)及激素信號(hào)相關(guān)的順式作用元件;葡萄糖處理‘嘎啦’組培苗一周后,MdVGT1的表達(dá)量明顯提高;酵母雙雜交試驗(yàn)表明,MdVGT1與MdTMT1在體外能相互作用,并通過(guò)原核誘導(dǎo)獲得了MdVGT1的重組蛋白。【結(jié)論】在‘紅脆1號(hào)’蘋果中克隆獲得了液泡膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdVGT1,其可能與MdTMT1互作共同轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入液泡膜。
【圖文】：

進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET28a-MdVGT1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DE3感受態(tài)中。加入1mmol·L-1IPTG后分別在0、2、4、6h時(shí)取樣于4℃暫時(shí)保存，取6h菌液離心收集菌體，用8mLPBS緩沖液懸浮，超聲破碎（打6s，停9s，25個(gè)循環(huán)）分離可溶性蛋白和包涵體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。1.7數(shù)據(jù)分析用Excel2007進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析，DPS7.05軟件進(jìn)行顯著性分析，Spss進(jìn)行相關(guān)性分析。2結(jié)果2.1MdVGT1的克隆與基因組結(jié)構(gòu)分析如圖1所示，獲得了一條大小約為1500bp的條帶，，與預(yù)期大小一致，序列測(cè)定與分析表明，MdVGT1圖1MdVGT1編碼區(qū)全長(zhǎng)的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1AgarosegelelectrophoresisofMdVGT1RT-PCRproducts

蛋白基因MdVGT1的克隆與表達(dá)分析4587的完整開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1506bp，編碼501個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為53.16kD，等電點(diǎn)為5.92。利用GDR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rosaceae.org/）分析MdVGT1的染色體位置和基因結(jié)構(gòu)。如圖2所示，MdVGT1位于蘋果基因組的1號(hào)染色體上，由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。2.2MdVGT1的進(jìn)化樹(shù)和結(jié)構(gòu)功能域如圖3所示，液泡單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TMT和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SUT/SUC分別在不同物種間都在同一個(gè)進(jìn)化樹(shù)枝上，因其具有相同的功能。而MdVGT1和擬南芥AtVGT1同樣在同一個(gè)進(jìn)化樹(shù)枝上，推測(cè)蘋果MdVGT1圖2MdVGT1染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)Fig.2ChromosomallocationandgenomicstructureoftheMdVGT1圖3糖代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3Phylogenetictreeofrelativetransporteringlycometabolism與擬南芥AtVGT1的功能相似（圖3中比例尺0.1代表每10個(gè)氨基酸有1個(gè)不同）。SMART功能域分析表明MdVGT1有12個(gè)跨膜區(qū)域。2.3MdVGT1組織表達(dá)特性及果實(shí)發(fā)育過(guò)程中MdVGT1表達(dá)量與葡萄糖含量相關(guān)性由圖4可得，MdVGT1在根、莖、葉、花、果實(shí)中都有表達(dá)，其中在葉、花和果實(shí)中具有較高的表達(dá)。由圖5可得，MdVGT1表達(dá)量和葡萄糖含量均在花后120d達(dá)到最大值，經(jīng)Spss顯著性分析可得，MdVGT1表達(dá)量和葡萄糖含量在0.05水平上顯著相關(guān)（顯著性系數(shù)為0.986）。2.4MdVGT1啟動(dòng)子順式作用元件和葡萄糖處理‘嘎啦’組培苗MdVGT1的表達(dá)利用https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace網(wǎng)址分析MdVGT1啟動(dòng)子的順式作用元件，結(jié)果如表1。MdVGT1啟動(dòng)子序列含有多個(gè)與抗逆性相關(guān)的作用元件：ACGTATERD1和MYBCORE是與脫水相關(guān)的元件[19-21]，MYB1LEPR是與防御相關(guān)的元件[22]，

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