發(fā)布時(shí)間：2019-10-04 02:09

【摘要】：白蠟蟲Ericerus pela Chavannes是我國(guó)特有的資源昆蟲,具有特化的泌蠟性狀,其分泌的白蠟廣泛用于機(jī)械、輕工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)。蠟酯合酶(wax synthase,WS)是生物蠟酯合成途徑中的關(guān)鍵酶之一,目前在昆蟲中尚未鑒定出WS。本研究旨在獲得白蠟蟲蠟酯合酶基因cDNA全長(zhǎng),分析白蠟蟲WS氨基酸序列,并在大腸桿菌中成功表達(dá)白蠟蟲WS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)白蠟蟲WS抗體制備、組織及亞細(xì)胞定位研究奠定基礎(chǔ),指導(dǎo)功能研究、酶活測(cè)定等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利完成,也為其它昆蟲蠟酯合成研究提供了參考。詳細(xì)結(jié)果如下:1.白蠟蟲ws基因cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)獲得的白蠟蟲ws基因247bp的部分序列,采用Rapid Amplification of cDNA End(RACE)技術(shù)獲得白蠟蟲ws基因cDNA全長(zhǎng)1518bp,ws基因開放閱讀框1356bp,5’端非編碼區(qū)94bp,3’端非編碼區(qū)68bp。氨基酸序列預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,白蠟蟲WS編碼452個(gè)氨基酸,分子量為51.8kDa,理論等電點(diǎn)為6.35,脂溶系數(shù)為90.46,在N端具有一個(gè)分泌型信號(hào)肽,并且在N端存在一個(gè)包含22個(gè)氨基酸殘基跨膜區(qū)域。根據(jù)WS氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,顯示白蠟蟲WS并未與已知其他物種WS聚為一支。研究結(jié)果顯示白蠟蟲WS的序列結(jié)構(gòu)、跨膜方式、保守區(qū)域都與已知的其他物種WS都不相同,對(duì)白蠟蟲WS的鑒定需要更多后續(xù)的研究。2.白蠟蟲WS原核表達(dá)通過(guò)分析白蠟蟲WS的序列結(jié)構(gòu),選取其中特異性較好、親水性較高的一段多肽,在序列末端添加組氨酸標(biāo)簽,設(shè)計(jì)兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增目的片段。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22b/EpelWS,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),以28℃,1mM IPTG終濃度的條件分別誘導(dǎo)大腸桿菌大量表達(dá)目的蛋白。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示,IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌中出現(xiàn)目的條帶。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,帶有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與小鼠抗6×His tag一抗、結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的二抗發(fā)生特異性結(jié)合,證實(shí)了白蠟蟲WS在大腸桿菌中大量表達(dá)。
【圖文】：

芥中發(fā)現(xiàn)了新的蠟酯合成途徑—脫羰基途徑，區(qū)別于先途徑會(huì)先將 C16 和 C18 脂酰輔酶 A 延伸為 C24 至 C34成脂肪醛、仲醇、酮及烷烴。這一途徑多為植物角質(zhì)層牛等植物中已鑒定出許多角質(zhì)層蠟合成基因，角質(zhì)層蠟脂肪醇酯化形成。但由于這一途徑產(chǎn)生許多的中間產(chǎn)物帶來(lái)了諸多不便，許多蠟酯合成相關(guān)基因的功能尚不清lypina et al., 2008; King et al., 2007; Kunst et al., 2003）。assica napus）中角質(zhì)層蠟酯合成途徑中編碼合成烷烴的滑表皮性狀的突變株，表皮中蠟酯含量大大減少。這也蠟酯合成途徑屬于脫羰基途徑（Pu et al., 2013）。兩種蠟

圖 1-2 小鼠不同器官中 WS mRNA 的表達(dá)水平g.1-2 WS expression levels of mRNAin different organs of mouse（引自 Cheng et al., 20酯在植物中的功能主要包括作為儲(chǔ)能物質(zhì)及構(gòu)成角質(zhì)層。荷荷巴種子中蠟 97％，，在其種子胚乳中存在大量的 WS，蠟酯是種子萌發(fā)最主要的供abal et al., 2000）。Li 在對(duì)擬南芥莖干蠟酯合成途徑關(guān)鍵酶 WS 的研究發(fā)現(xiàn)僅有 0.1％到 0.2％的蠟酯，莖干中也只有 0.7％到 2.9％。而在巴西rnicia cerifera）葉片蠟層中含有超過(guò) 85％的蠟酯（Kolattukudy, 1976），說(shuō)物中的分布有很大差異。對(duì)擬南芥進(jìn)行 WS 器官特異性模型的分析中，發(fā) 表達(dá)水平最高，莖干、葉片次之，WS 在種子和根部?jī)H有痕量表達(dá)，說(shuō)明各物學(xué)功能的不同對(duì) WS 分布有重要影響（Li et al., 2008）。通過(guò) Northern B矮牽牛中 WS 在花瓣中表達(dá)水平最高，葉片次之（King et al., 2007）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S899.1

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本文編號(hào)：2545695