【摘要】：脂肪組織遍布于全身各處,長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是機(jī)體儲(chǔ)存能量的主要部位。除了儲(chǔ)存多余能量,脂肪組織作為機(jī)體內(nèi)高度活躍的內(nèi)分泌器官,可分泌產(chǎn)生多種脂肪因子。這些脂肪因子可作用于局部脂肪組織,也可通過(guò)血液循環(huán)作用于其他組織器官。它們?cè)谏矬w內(nèi)的平衡與能量代謝、心腦血管功能、免疫炎癥等過(guò)程密切相關(guān)。一旦這種平衡被打破,由此引發(fā)的代謝紊亂、免疫系統(tǒng)異常將會(huì)導(dǎo)致肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化以及諸多心腦血管疾病的發(fā)生。因此,對(duì)脂肪因子的深入研究,對(duì)新脂肪因子的發(fā)現(xiàn)和功能闡明對(duì)疾病的診斷、治療和預(yù)防都具有非常重大的意義。本課題利用細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)基因小鼠和分子特異性抑制劑研究脂肪因子Metrnl和Nampt在機(jī)體內(nèi)的重要功能,并對(duì)機(jī)制進(jìn)行了深入研究。本課題分為以下兩個(gè)部分。第一部分為Metrnl調(diào)節(jié)胰島素敏感性的機(jī)制研究。我們前期的研究結(jié)果表明,Metrnl是一種分泌蛋白,高表達(dá)于小鼠和人的皮下白色脂肪。在限食情況下,白色脂肪中Metrnl的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)下調(diào)。而在高脂飲食(High fat diet,HFD)喂養(yǎng)的肥胖小鼠中,白色脂肪的Metrnl會(huì)出現(xiàn)顯著升高。此外,Metrnl的表達(dá)在白色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中也會(huì)顯著增加。一系列結(jié)果提示Metrnl作為一種脂肪因子,可能參與調(diào)節(jié)白色脂肪的生物學(xué)功能和能量代謝。我們前期利用基因工程手段制備了脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)Metrnl小鼠(Metrnl-Tg)以及脂肪細(xì)胞特異性敲除Metrnl小鼠(Metrnl-/-)。在這部分實(shí)驗(yàn)中,我們首先對(duì)Metrnl-/-小鼠的鑒定方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化,建立了Metrnl細(xì)胞特異性敲除小鼠鑒定方法的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。運(yùn)用葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(GTT),我們?cè)俅悟?yàn)證Metrnl-/-將會(huì)加重HFD引起的胰島素抵抗,而脂肪細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)Metrnl可以對(duì)抗HFD或者瘦素缺乏引起的胰島素抵抗。在胰島素信號(hào)通路的研究中我們發(fā)現(xiàn),Metrnl可顯著提高白色脂肪胰島素作用下AKT的磷酸化水平。為了進(jìn)一步明確Metrnl增敏作用的機(jī)制,我們運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)手段,對(duì)調(diào)節(jié)胰島素敏感性的多種機(jī)制進(jìn)行了探索。研究結(jié)果表明,Metrnl可抑制炎癥因子的表達(dá)、改善脂質(zhì)代謝、促進(jìn)脂肪分化從而提高胰島素敏感性。我們還檢測(cè)到Metrnl在脂肪組織和成熟脂肪細(xì)胞中的分泌,并證實(shí)Metrnl可通過(guò)分泌的形式促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。使用PPARγ小分子化學(xué)抑制劑或者PPARγ干擾慢病毒可以阻斷Metrnl的胰島素增敏作用,證明了Metrnl可通過(guò)PPARγ參與機(jī)體胰島素敏感性的調(diào)節(jié)。通過(guò)這一部分實(shí)驗(yàn),我們闡明了Metrnl在白色脂肪中的重要功能。脂肪組織Metrnl可通過(guò)PPARγ信號(hào)通路促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、改善代謝、抑制炎癥從而調(diào)節(jié)脂肪功能,對(duì)抗肥胖引起的胰島素抵抗,有望成為治療代謝綜合征和2型糖尿病的新靶點(diǎn)。第二部分為Nampt在限食調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激以及線粒體生物合成中的作用。限食也被稱為飲食干預(yù),是一種限制能量攝入的飲食調(diào)理手段。限食在延緩衰老、改善代謝、預(yù)防多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。SIRT家族是介導(dǎo)限食效應(yīng)的關(guān)鍵分子,SIRT活性依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的生物合成。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)是NAD+生物合成中的重要限速酶,我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了Nampt參與限食介導(dǎo)的代謝功能改善作用。在這部分實(shí)驗(yàn)中,我們使用Nampt特異性化學(xué)抑制劑FK866全身性抑制Nampt酶活性,發(fā)現(xiàn)限食介導(dǎo)的SIRT3活性的增強(qiáng)、氧化應(yīng)激水平的下降、抗氧化能力以及線粒體生物合成能力的增強(qiáng)都會(huì)被取消,證明了Nampt在限食調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激以及線粒體生物合成中的重要作用。
【圖文】：

現(xiàn)較明顯的條帶，只是條帶亮度略有差別（圖 1，圖 2）判斷小鼠基因型，判斷的結(jié)果極有可能出現(xiàn)假陰性或者因小鼠的培育工作造成很大的困擾。理論知識(shí)并結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為造成上述鑒定結(jié)果幾個(gè)方面：①在小鼠剪尾過(guò)程中，由于使用的是同一把剪刀未完全擦拭干凈，導(dǎo)致上一個(gè)鼠尾樣本的殘留組織樣本中，造成不同個(gè)體間基因組有交叉污染。②不同鼠同，造成樣本之間基因組 DNA 濃度不同，目的片段擴(kuò)帶亮度不同。③目的基因擴(kuò)增使用的反應(yīng)酶特異性不夠性較強(qiáng)，擴(kuò)增出與目的基因片段大小接近的非特異性片了相應(yīng)調(diào)整并做了如下比較實(shí)驗(yàn)：①比較同一把剪刀會(huì)造成鑒定結(jié)果差異。②在 PCR 擴(kuò)增體系中增設(shè)內(nèi)參組 DNA 濃度差異造成的結(jié)果判斷失誤，亦可排除 DN結(jié)果。 ③比較常規(guī)普通基因組 PCR 擴(kuò)增酶 Primix Taq HiFi PCR SuperMix 對(duì) Cre 基因擴(kuò)增特異性差異。我們條件進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)。比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

圖 2.不同剪刀剪尾，使用 Primix Taq PCR 擴(kuò)增酶gure 2 Genotyping of Fabp4-Cre using different scissors and 圖 3.同一把剪刀剪尾，，使用 TransTaq HiFi PCR SuperMFigure 3 Genotyping of Fabp4-Cre using a same scisTransTaq HiFi PCR SuperMix
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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