【摘要】：米曲霉(Aspergillus oyzae)能夠分泌高活力的酶,因而被長時間應(yīng)用在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)中。米曲霉中性蛋白酶(neutral protease)的分解作用將原料中的蛋白質(zhì)發(fā)酵水解成多種氨基酸。本研究以米曲霉中性蛋白酶I(NPI)作為對象,分析糖基化對蛋白酶活力的影響,并進(jìn)一步構(gòu)建食品級高活力的中性蛋白酶基因米曲霉工程菌。主要研究內(nèi)容如下:1對中性蛋白酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬,分析發(fā)生突變的位置,發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)都發(fā)生在蛋白酶表面。利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了表達(dá)載體p PIC9K-NPI-P56Y-6His和p PIC9K-NPI-N41AP56Y-6His,轉(zhuǎn)入畢赤酵母Gs115。利用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達(dá),分別在60 h和72 h達(dá)到最大酶活42 U/m L和60 U/m L。對表達(dá)的蛋白酶進(jìn)行硫酸銨沉淀和鎳柱純化,SDS-PAGE分析得蛋白分子量大小分別為70 KDa和50 KDa左右。對中性蛋白酶的活力進(jìn)行測定:r NPI的酶活為217U/mg,r NPI-P56Y的酶活為242 U/mg,r NPI-N41AP56Y的酶活為147 U/mg。2以尿嘧啶依賴的米曲霉工程菌AS11為出發(fā)菌株,以0.8 M Na Cl溶液作為滲透壓緩沖液制備米曲霉原生質(zhì)體,原生質(zhì)體濃度達(dá)到8.5×106個/m L,再生率為22%。構(gòu)建了打靶載體p NP-NPI-6His、p NP-NPI-Y122FK246ID382V-6His和p NP-NPI-Y122FK246ID382VY186S-6His。轉(zhuǎn)化米曲霉原生質(zhì)體。三株轉(zhuǎn)化子分別命名為:米曲霉D(p NP-NPI-6His)、米曲霉E(p NP-NPI-Y122FK246ID382V-6His)和米曲霉F(p NP-NPI-Y122FK246ID382V-Y186S-6His)。米曲霉AS11的酶活為3100.36U/g;米曲霉B的酶活為2290.81 U/g;米曲霉D、E、F的酶活分別為3978.41 U/g、4435.62 U/g和3540.27 U/g。
【圖文】：

[28]。圖1-1 原生質(zhì)體化學(xué)轉(zhuǎn)化[28]Fig 1-1 Chemical transformation of protoplast1.4.2 轉(zhuǎn)化子的篩選轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中存在大量的未轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，必須依賴選擇性的標(biāo)記才能從其

第二章 米曲霉重組中性蛋白酶的糖基化對酶活的影響的構(gòu)建因 NPI-P56Y 和 NPI-N41AP56Y 的獲取組 NPI 糖基化對中性蛋白酶活力的影響，采用不同的模化位點(diǎn)和改變糖基化位點(diǎn)的重疊延伸 PCR，使成熟肽氨酸脯氨酸突變?yōu)槔野彼幔赃_(dá)到在 56 位處增加糖基化識 所示的是兩輪 PCR 產(chǎn)物的凝膠電泳分析，A 片段大小為小為 1000bp 左右，，基因全長為 1900bp 左右，從圖中可以的基因大小相符。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q936

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本文編號：2530120