【摘要】：結(jié)核病是威脅全球健康的慢性傳染性人畜共患病,目前缺乏有效的預(yù)防和根治方法。目前認(rèn)為結(jié)核病的發(fā)病機(jī)理是:致病性結(jié)核分支桿菌通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi),與肺部巨噬細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后形成吞噬小體,通過(guò)獲取鐵等金屬離子,產(chǎn)生大量活性酶類,從而抵抗巨噬細(xì)胞的殺傷作用,在細(xì)胞內(nèi)寄生,從而難以治愈。Nramp1蛋白的功能之一是將金屬離子從吞噬體內(nèi)腔轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi),通過(guò)限制金屬離子限制病菌生產(chǎn)活性酶的能力,阻止結(jié)核分支桿菌的增殖。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段來(lái)增強(qiáng)羊Nramp1基因過(guò)表達(dá),培育抗病種群,可成為控制羊結(jié)核病一個(gè)新的切入點(diǎn)。Cre/loxp位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)由Cre重組酶和loxp位點(diǎn)兩部分組成,Cre重組酶不僅具有催化活性,而且與限制酶相似,能識(shí)別特異的DNA序列,即loxP位點(diǎn),使loxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。該定點(diǎn)整合方法主要有以下優(yōu)點(diǎn):(1)外源基因能夠準(zhǔn)確地整合到宿主染色體的特定位點(diǎn);(2)減少轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的拷貝數(shù),整合上的外源基因多數(shù)都是未發(fā)生重排的單拷貝。本研究主要通過(guò)Cre/loxp重組酶系統(tǒng)將Nramp1基因定點(diǎn)整合入人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊細(xì)胞內(nèi),從而通過(guò)核移植方法制備抗結(jié)核分支桿菌的Nramp1轉(zhuǎn)基因山羊。首先分離了人溶菌酶高表達(dá)轉(zhuǎn)基因山羊耳成纖維細(xì)胞3-376♂,其基因組內(nèi)包括盒式交換系統(tǒng)loxp1-Neo-Tk-loxp表達(dá)框架,并且此框架中l(wèi)oxp序列為突變型,即將野生型loxp位點(diǎn)的反向重復(fù)序列“ATAAC”突變?yōu)椤癈ACCT”。人工合成含有Nrampl基因的表達(dá)框架,第132位氨基酸由異亮氨酸(I)突變?yōu)樘K氨酸(T),此突變蛋白特異性表達(dá)于巨噬細(xì)胞中,具有抗胞內(nèi)菌活性,尤其適用于預(yù)防和治療胞內(nèi)菌引起的感染。通過(guò)酶切,連接等步驟得到框架為 loxp2-polyA-Nrampl-Purocoda-loxp 的Nramp1 定點(diǎn)表達(dá)載體質(zhì)粒 pTM-Nramp1。將上述pTM-Nramp1質(zhì)粒與pBS185質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染3-376♂細(xì)胞,嘌呤霉素抗性篩選得到22株克隆,經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定,其中3株目的基因已經(jīng)整合到預(yù)定位點(diǎn),為定位整合陽(yáng)性細(xì)胞株,整合效率為13.6%(3/22),挑取其中狀態(tài)良好的11號(hào)細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的核供體。挑選50頭2歲左右健康母羊作為供體羊,同步發(fā)情,超數(shù)排卵處理后獲得卵母細(xì)胞總數(shù)為155個(gè),移核卵數(shù)111個(gè),融合后獲得重構(gòu)胚105株,融合率94.59%(105/111),移植入13頭受體母羊輸卵管內(nèi)。35天后進(jìn)行B超妊娠檢查,共檢查到6頭母羊出現(xiàn)孕囊,懷孕率為46%(6/13)。47天時(shí)剖腹取出一個(gè)胎兒,155天順產(chǎn)獲得一只健康公羊,經(jīng)PCR方法和測(cè)序鑒定,此胎兒和新生小羊均為Nramp1定位整合轉(zhuǎn)基因公羊,該公羊目前仍然健康,這為Nramp1轉(zhuǎn)基因羊的擴(kuò)繁奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖１－１巨噬細(xì)胞內(nèi)ＮＲＡＭＰ丨介導(dǎo)的二價(jià)金屬離子流出機(jī)制模式圖Ｍ逡逑膜上的黑色小圓圈代表ＮＲＡＭＰ１蛋白。細(xì)菌細(xì)胞膜上的黑色小圓圈代表ＮＲ物。此圖顯示的是動(dòng)物的ＮＲＡＭＰ１和細(xì)菌的ＮＲＡＭＰ１在爭(zhēng)奪各自生命活動(dòng)所價(jià)金屬離子。逡逑

使用ＲＨＹＴＨＭ程序進(jìn)行穿膜螺旋（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｈｅｌｉｃｅｓ邋）分析（ｈｔｔｐ：／／逡逑ｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．邋ｃｈａｒｉｔｅ．ｄｅ／ｒｈｙｔｈｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｉｔｅ＝ｈｏｍｅ），結(jié)果表明山羊天然邋ＮＲＡＭＰ１邋蛋逡逑白有１２個(gè)跨膜區(qū)，即有６個(gè)膜內(nèi)袢，５個(gè)膜外袢（如圖１－２），第１，３，邋５，邋７，邋９和１１袢逡逑位于膜外側(cè)，第２，邋４，邋６，邋８，，１０袢位于膜內(nèi)側(cè)，其Ｎ端和Ｃ端均位于膜內(nèi)側(cè)。１－８跨膜逡逑區(qū)具有高度的同源性。膜內(nèi)袢８有一個(gè)多種細(xì)菌和真核生物膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體進(jìn)化上高逡逑度保守的轉(zhuǎn)運(yùn)功能域［１１］。逡逑雖然ＮＲＡＭＰ１的各個(gè)跨膜區(qū)及各袢的具體功能還未能完全揭示，但膜內(nèi)區(qū)對(duì)于激發(fā)逡逑囊泡內(nèi)的生物學(xué)功能具有潛在功能。經(jīng)生物信息學(xué)分析以及對(duì)區(qū)段和位點(diǎn)的篩選發(fā)現(xiàn)，山逡逑羊ＮＲＡＭＰ１膜內(nèi)袢２上有一個(gè)潛在的蛋白激酶Ｃ邋（ＰＫＣ）磷酸化位點(diǎn)ＴＧＫ邋（１１４－１１６）和逡逑一個(gè)潛在的酪蛋白激酶ＩＩ邋（ＣＫ２）的磷酸化位點(diǎn)ＴＧＫＤ邋（１１４邋－１４７）。蛋白激酶Ｃ活化了逡逑Ｎａ＋、Ｋ＋交換系統(tǒng)、使細(xì)胞內(nèi)Ｈ＋減少、提高細(xì)胞質(zhì)中的ｐＨ，還提高了邋Ｎａ＋／Ｋ＋泵的運(yùn)轉(zhuǎn)。逡逑在神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中，ＣＫ２通過(guò)磷酸化突觸結(jié)合蛋白、突觸融合蛋白和發(fā)動(dòng)蛋白２］調(diào)節(jié)了逡逑突觸小泡的跨膜運(yùn)輸，形成了一種調(diào)節(jié)突觸效率的突觸前作用機(jī)制。突觸結(jié)合蛋白的跨膜逡逑域涉及突觸小泡與突觸前質(zhì)膜間相互作用的調(diào)節(jié)。突觸融合蛋白具有調(diào)節(jié)突觸結(jié)合蛋白與逡逑Ｎ２型Ｃａ２＋通道間相互作用的功能。發(fā)動(dòng)蛋白２１在復(fù)極化時(shí)，ＰＫＣ磷酸化可誘導(dǎo)除去Ｃａ２＋；逡逑而在去極化時(shí)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.27

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本文編號(hào)：2526095