【摘要】：【研究背景及目的】結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是該病的主要死因,其轉(zhuǎn)移機(jī)制已成為目前的研究熱點(diǎn)。近年來(lái),越來(lái)越多研究表明上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)發(fā)揮關(guān)鍵作用。Martin等學(xué)者研究表明,三聯(lián)組氨酸結(jié)合蛋白2(Histidine triad nucleotide-binding 2,HINT2)對(duì)腫瘤組織的生長(zhǎng)起抑制作用,且該蛋白可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組織中HINT2表達(dá)量明顯低于正常結(jié)腸組織,且HINT2對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力具有抑制作用。因此,本課題的目的是探究HINT2在結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT中的作用,并探討相關(guān)的分子機(jī)制。【實(shí)驗(yàn)方法】1.建立穩(wěn)定沉默HINT2的SW480細(xì)胞系將結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480感染重組慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles(sc-92707-V)的方法敲除HINT2,并用有限稀釋克隆法建立穩(wěn)定沉默細(xì)胞系。2.檢測(cè)HINT2對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株EMT的影響2.1.利用慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles感染結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480,下調(diào)細(xì)胞株中HINT2表達(dá),顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,利用Western blot方法檢測(cè)HINT2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)量變化情況。2.2.構(gòu)建包含E-cadherin啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入Hint2 shRNA(h)Lentiviral Particles、Control sh RNA Lentiviral Particles-A的SW480細(xì)胞株,通過(guò)檢測(cè)熒光素酶表達(dá)水平預(yù)測(cè)HINT2對(duì)E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用。3.觀察HINT2變化對(duì)SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞株遷移及侵襲能力的影響用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)及Transwell試驗(yàn)檢測(cè)不同HINT2表達(dá)水平對(duì)SW480細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。4.探討HINT2抑制SW480細(xì)胞EMT的分子機(jī)制4.1.利用Real-time PCR檢測(cè)下調(diào)HINT2表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2、TWIST1、TWIST2表達(dá)的影響。4.2.制備HINT2與ZEB1雙干擾慢病毒HINT2+ZEB1 shRNA Lentiviral Particles。4.3.利用慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 sh RNA Lentiviral Particles或Control sh RNA Lentiviral Particles-A感染結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480,利用Western blot方法檢測(cè)HINT2、ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)量變化情況。4.4.構(gòu)建包含E-cadherin啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入Hint2 shRNA(h)Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 sh RNA Lentiviral Particles或Control sh RNA Lentiviral Particles-A的SW480細(xì)胞株,通過(guò)檢測(cè)熒光素酶表達(dá)水平預(yù)測(cè)ZEB1在HINT2介導(dǎo)的E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析懫用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有的結(jié)果都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn),P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.成功建立低表達(dá)HINT2的SW480細(xì)胞系。2.在SW480細(xì)胞中小干擾HINT2后,細(xì)胞形態(tài)由渾圓變得細(xì)長(zhǎng),出現(xiàn)梭形觸角,E-cadherin表達(dá)下降,N-cadherin、Vimentin表達(dá)量明顯上升。3.熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示HINT2通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)E-cadherin表達(dá)。4.利用慢病毒載體下調(diào)HINT2表達(dá)后,細(xì)胞劃痕試驗(yàn)及Transwell方法檢測(cè)結(jié)果顯示HINT2顯著抑制SW480細(xì)胞的侵襲、遷移能力。5.在SW480細(xì)胞中同時(shí)干擾HINT2及ZEB1后,EMT分子標(biāo)記物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)表達(dá)量相較對(duì)照組無(wú)明顯變化。熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示在SW480細(xì)胞中同時(shí)干擾HINT2及ZEB1,E-cadherin啟動(dòng)子活性相較對(duì)照組未發(fā)生變化�！窘Y(jié)論】1.HINT2可抑制SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT。2.HINT2可正性調(diào)控SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。3.HINT2可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。4.ZEB1是低表達(dá)HINT2誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT所必需的。5.低表達(dá)HINT2對(duì)E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性的負(fù)性調(diào)控依賴于ZEB1表達(dá)
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2460972