【摘要】：近年來大量研究表明,表觀遺傳修飾異常不但影響神經(jīng)元的發(fā)育及突觸可塑性,而且和多種認(rèn)知障礙性神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化及去甲基化、組蛋白乙�；⒎蔷幋amicro RNA干擾等多種不涉及DNA序列改變而對基因功能進(jìn)行的可逆可遺傳性調(diào)節(jié)過程。DNA甲基化(DNA Methylation)是表觀遺傳修飾的一種重要形式,通過游離甲基與雙鏈DNA序列上Cp G島的胞嘧啶堿基C5碳原子的共價結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。DNA甲基化過程由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,Dnmts)催化完成。真核生物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的DNA甲基化酶主要包括Dnmt1,Dnmt3a以及Dnmt3b三種。雖然Dnmt3b在成熟神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)水平明顯下降,但其對突觸可塑性和記憶形成仍有重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究證據(jù)表明Dnmt3b參與學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)過程,但其內(nèi)在分子生物學(xué)機(jī)制尚未闡明。因此,為了更加深入的探討Dnmt3b基因在成熟神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶過程中的作用及機(jī)制,我們用AAV-Cre-GFP病毒定位注射的方法條件性敲除Dnmt3b基因在小鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá),同時用αCa MKII-Cre工具鼠建立αCa MKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox條件性興奮性神經(jīng)元基因敲除小鼠,應(yīng)用高架十字迷宮、曠場實(shí)驗(yàn)、新物體識別、新位置識別、Morris水迷宮等行為學(xué)范式對兩種條件性敲除小鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測試。并應(yīng)用原代細(xì)胞培養(yǎng)、鈣離子成像、基因表達(dá)譜芯片等技術(shù)從細(xì)胞水平及分子水平進(jìn)一步探討其內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果如下:1.慢病毒注射方法在成年小鼠海馬CA1區(qū)敲除Dnmt3b基因后,小鼠自發(fā)活動、探索能力均未受到影響,且不存在焦慮等情緒障礙。2.成年小鼠海馬CA1區(qū)條件性Dnmt3b基因敲除影響小鼠的位置識別記憶。3.αCaMKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox基因敲除小鼠的自發(fā)活動及焦慮狀態(tài)無異常。4.αCa MKII-Cre;Dnmt3b2lox/2lox基因敲除小鼠表現(xiàn)出位置識別記憶障礙。5.慢病毒敲除Dnmt3b基因不影響原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(DIV 21天)樹突形態(tài)及興奮性突觸形成。6.慢病毒敲除Dnmt3b基因增加原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(DIV 21天)谷氨酸(50μM)誘導(dǎo)的胞體內(nèi)鈣濃度增加。7.用基因表達(dá)芯片技術(shù)分別對AAV病毒注射小鼠以及αCaMKII-Cre條件性基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選,篩選出的差異表達(dá)基因用real-time q RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,α-2,6唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶(betagalactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 2,St6gal2)在病毒注射小鼠以及αCa MKII-Cre條件敲除小鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)均上調(diào),差異達(dá)2.5倍以上,且有統(tǒng)計學(xué)意義。8.條件性敲除小鼠海馬神經(jīng)元中的Dnmt3b基因引起小鼠海馬區(qū)Dnmt1及Dnmt3a的表達(dá)量代償性增高。而新物體識別(NPR)訓(xùn)練1h后條件性敲除小鼠海馬區(qū)Dnmt1基因表達(dá)顯著下降。綜上所述,在病毒介導(dǎo)的局部腦區(qū)基因敲除和遺傳性條件性基因敲除兩種模型小鼠上,我們研究發(fā)現(xiàn),條件性敲除小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元中Dnmt3b基因可導(dǎo)致小鼠海馬依賴的物體位置識別記憶障礙。Dnmt3b基因敲除不影響海馬神經(jīng)元的樹突形態(tài)及興奮性突觸形成,但是可明顯促進(jìn)谷氨酸誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度的增加,提示Dnmt3b基因敲除顯著增加海馬神經(jīng)元的活動。根據(jù)基因芯片篩選并驗(yàn)證的結(jié)果,我們推測Dnmt3b基因敲除上調(diào)了唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),并通過改變神經(jīng)元內(nèi)糖蛋白及糖脂的唾液酸酸化作用造成海馬神經(jīng)元的過度激活及鈣超載,從而影響了海馬神經(jīng)環(huán)路突觸的傳遞及(或)可塑性,并影響了小鼠的物體位置識別記憶過程,內(nèi)在的細(xì)胞及突觸傳遞等具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。為驗(yàn)證這一假說,我們正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)包括:(1)用western blot的方法分析DNMTs,St6gal2和它的反應(yīng)底物PSA-NCAM蛋白在海馬的表達(dá)。(2)在腦片上用電生理方法記錄海馬突觸傳遞及可塑性變化。(3)考察海馬CA1區(qū)注射St6gal2抗體或病毒介導(dǎo)特異性sh RNA表達(dá),以拮抗St6gal2表達(dá)上調(diào),是否能反轉(zhuǎn)dnmt3b敲除引起的物體位置識別記憶障礙。值得注意的是,我們還發(fā)現(xiàn),正常小鼠新物體識別(NPR)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練后海馬區(qū)Dnmt1基因的表達(dá)顯著下降,提示Dnmt1基因表達(dá)的可塑性下調(diào)可能與小鼠NPR記憶的形成相關(guān)。Dnmt3b基因敲除引起的Dnmt1和Dnmt3a的表達(dá)代償性增加,可能阻礙了這種活動依賴性的Dnmt1可塑性下調(diào),從而參與了位置識別記憶障礙的形成。因此,我們認(rèn)為直接分子機(jī)制(St6gal2表達(dá)上調(diào))和間接分子機(jī)制(Dnmt1代償性上調(diào))可能共同參與了海馬Dnmt3b基因敲除所致的新物體識別記憶障礙形成,具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749

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