本文關(guān)鍵詞： 耐藥菌 耐藥基因 接合轉(zhuǎn)移 腸道 斑馬魚(yú) 水環(huán)境　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:環(huán)境中抗生素耐藥性細(xì)菌(簡(jiǎn)稱(chēng)耐藥菌)的污染及抗生素耐藥基因的擴(kuò)散已成為全球危機(jī)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,耐藥菌正蔓延至世界各地,到2050年,抗生素耐藥每年將導(dǎo)致100萬(wàn)人早死。抗生素耐藥基因的擴(kuò)散情況日趨嚴(yán)峻,以至于其已被列為一項(xiàng)新型環(huán)境污染物,成為當(dāng)今國(guó)際研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。抗生素耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致耐藥基因擴(kuò)散的重要原因。耐藥基因大多編碼在質(zhì)粒上,通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移將耐藥基因在微生物間進(jìn)行傳播和擴(kuò)散是基因轉(zhuǎn)移最常見(jiàn),也是最有效的方式。地表水是耐藥菌和耐藥基因的巨大儲(chǔ)存庫(kù)。它不僅匯聚和容納了來(lái)自降水徑流,醫(yī)院污水、生活污水、養(yǎng)殖污水和實(shí)驗(yàn)室污水等各種來(lái)源的的耐藥菌、耐藥基因甚至多重耐藥基因外,還承載著一部分內(nèi)源性的污染,比如耐藥基因在水環(huán)境中的隨機(jī)耐藥突變和自然轉(zhuǎn)移。水生動(dòng)物是生存在水環(huán)境中的重要生物,其攝食的環(huán)境中充滿(mǎn)了耐藥菌和耐藥基因。水生動(dòng)物腸道是細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的重要場(chǎng)所,同時(shí),腸道中定植的大量固有菌群都可以作為潛在的受體菌。因此,耐藥基因在水生動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散也可能是地表水耐藥基因內(nèi)源性污染的一部分。但是,耐藥基因是否能在水生動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生擴(kuò)增,目前尚未見(jiàn)報(bào)道�；虬l(fā)生抗性突變和自然轉(zhuǎn)移的效率只有百萬(wàn)分之一。并且研究發(fā)現(xiàn),即使在水中存在的各種物理、化學(xué)和生物因素尤其是豐富的DNA酶類(lèi)的作用下,也無(wú)法使耐藥基因變性和分解。水中耐藥菌和耐藥基因的污染依然嚴(yán)重。除此之外,還有研究報(bào)道了在水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體及魚(yú)的糞便和腸道中檢出耐藥菌和耐藥質(zhì)粒。基于以上全部事實(shí),我們認(rèn)為水環(huán)境中的耐藥基因除了接納各種水體中的耐藥基因和在水環(huán)境中發(fā)生耐藥突變和隨機(jī)轉(zhuǎn)移的少量耐藥基因外,更主要的是其在水生動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)移與擴(kuò)增的結(jié)果。綜上所述,課題提出“水生動(dòng)物腸道是地表水中耐藥基因轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增的重要場(chǎng)所”假說(shuō)。研究目的和意義:本研究旨在通過(guò)建立耐藥基因在水生動(dòng)物體內(nèi)定植和轉(zhuǎn)移的模型,在采用細(xì)菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)等技術(shù)方法的基礎(chǔ)上,定性、定量地研究耐藥菌及耐藥基因在水體動(dòng)物體內(nèi)定植和轉(zhuǎn)移的規(guī)律,闡明耐藥基因在水生動(dòng)物腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增機(jī)制,摸清耐藥基因發(fā)生定植和轉(zhuǎn)移的消化道部位與轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)理,以及明確腸道內(nèi)接受耐藥基因的接合子的種類(lèi)和數(shù)量。課題研究成果為進(jìn)一步豐富人們對(duì)耐藥基因在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增的規(guī)律和機(jī)制的認(rèn)知及提供了充分的理論依據(jù),同時(shí)也為水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥,水源水保護(hù)以及生態(tài)環(huán)境的污染和管理提供了數(shù)據(jù)依據(jù)和技術(shù)支撐。研究?jī)?nèi)容和研究方法:(1)采用RED重組技術(shù)構(gòu)建供體菌K12Cm: RP4,并通過(guò)將供體菌飼喂給斑馬魚(yú)構(gòu)建RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)接合轉(zhuǎn)移模型。(2)采用選擇性平板篩選和qPCR技術(shù)研究斑馬魚(yú)糞便中耐藥菌和耐藥基因的體外排出量隨時(shí)間的變化規(guī)律。(3)利用選擇性平板篩選和qPCR技術(shù)研究耐藥菌和耐藥基因在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)的時(shí)空分布規(guī)律。(4)采用雙熒光標(biāo)記供體菌,流式細(xì)胞分選并聯(lián)合16S rDNA高通量測(cè)序的方法腸道鑒定腸道和糞便中受體菌的細(xì)菌物種和豐度組成。(5)利用qPCR法檢測(cè)RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移調(diào)控基因在斑馬魚(yú)腸道中的mRNA表達(dá)。研究結(jié)果:(1)斑馬魚(yú)腸道和糞便的固有菌群都不含有RP4質(zhì)粒,除了對(duì)氨芐青霉素耐藥外,對(duì)四環(huán)素,卡那霉素和氯霉素均敏感。因此課題利用RED重組技術(shù),在野生株大腸桿菌K12的基礎(chǔ)上構(gòu)建了基因組被氯霉素抗性基因cat標(biāo)記,并攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌K12Cm: RP4。通過(guò)每日定時(shí)定量向飼料中摻入供體菌,持續(xù)喂食斑馬魚(yú),建立耐藥質(zhì)粒在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)的接合轉(zhuǎn)移模型。(2)斑馬魚(yú)攝入的外源性耐藥菌,大部分排出體外并沉積在糞便。12%的糞便固有細(xì)菌通過(guò)RP4質(zhì)粒的接合作用獲得了耐藥基因。喂食斑馬魚(yú)供體菌90天后停止,糞便中耐藥菌和耐藥基因排出的規(guī)律曲線(xiàn)可以分為三個(gè)階段:上升期,平臺(tái)期和下降期。在攝入108cfu/(d·fish)供體菌的高劑量組,cat基因和traG基因在平臺(tái)期的糞便排出相對(duì)數(shù)量分別為2.37%和15%,而攝入107cfu/(d·fish)供體菌的中劑量組,cat基因和traG基因在平臺(tái)期的糞便排出相對(duì)數(shù)量都不到1%。與高劑量組相比,中劑量組的供體菌和接合子達(dá)到平臺(tái)期所用的時(shí)間更短,產(chǎn)生的接合子數(shù)少大約一個(gè)數(shù)量級(jí)。在攝入106cfu/(d·fish)供體菌的低劑量組中沒(méi)有觀察到明顯的供體菌和耐藥基因的排出規(guī)律,也沒(méi)有檢測(cè)到接合子。接合子的產(chǎn)生數(shù)量和到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間與供體菌的喂食濃度相關(guān)。(3)外源性耐藥菌和耐藥基因在整個(gè)消化道內(nèi)的分布是極不均勻的。前腸和中腸中耐藥菌和耐藥基因存在的數(shù)量較少,并且它們的分布沒(méi)有顯著性差異。后腸是外源性耐藥菌和接合子定植,以及耐藥基因分布的最主要的消化道場(chǎng)所,其中接合子的數(shù)量是其它腸段中的將近25倍。在喂食供體菌的過(guò)程中,耐藥菌可以在腸道內(nèi)定植,同時(shí)耐藥基因在腸道內(nèi)發(fā)生了大量的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。但是外源性供體菌K12Cm:RP4在腸道內(nèi)的定植具有暫時(shí)性,一旦斑馬魚(yú)不再攝入供體菌,腸道內(nèi)的耐藥菌和接合子數(shù)量會(huì)迅速下降,這可能是與腸道內(nèi)缺乏抗生素選擇壓力有關(guān)。(4)腸道和糞便的接合子中既包括可培養(yǎng)細(xì)菌,也包括非可培養(yǎng)細(xì)菌,后者占全部接合子的90.4%～97.2%。其中氣單胞菌屬(Aeromonas)豐度最高,占全部細(xì)菌的90%以上(均值為90.0%～96.7%),是腸道固有菌群中接合轉(zhuǎn)移發(fā)生頻率最高,最容易獲得RK2質(zhì)粒的物種。其它的接合子主要來(lái)自Proteobacteria,Firmicutes和Fusobacteria菌門(mén)(加起來(lái)占大約5%)。除Aerowonas外,來(lái)自Proteobacteria門(mén)的可培養(yǎng)細(xì)菌Shewanella以及Enterobacteriaceae也是腸道固有菌群中重要的接合子。(5)耐藥質(zhì)粒在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移和大量擴(kuò)增與調(diào)控基因在后腸的mRNA表達(dá)有關(guān)。在平臺(tái)期,后腸中trbBp基因的mRNA表達(dá)量上調(diào)到7.16× 10-3 copies/cell,是上升期mRNA表達(dá)量的24倍。TrbBp基因的明顯上調(diào)促使了細(xì)胞間的交配配對(duì),從而形成接合的通道,促進(jìn)了接合轉(zhuǎn)移的第一步過(guò)程。同時(shí),平臺(tái)期trfAp基因的mRNA表達(dá)也在后腸出現(xiàn)了明顯的上調(diào),均值達(dá)到2.42×10-2 copies/cell,促使了RP4質(zhì)粒攜帶耐藥基因的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),以及質(zhì)粒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)移和分配,從而促進(jìn)了接合轉(zhuǎn)移的第二個(gè)過(guò)程。然而在前腸和中腸,平臺(tái)期trbBp和trfAp基因的mRNA表達(dá)則上調(diào)的不夠顯著。因此,后腸是耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率最高并且最活躍的消化道腸段。研究結(jié)論:1、建立了穩(wěn)定的RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的水生動(dòng)物模型。2、斑馬魚(yú)攝入的外源性耐藥菌,大部分會(huì)排出體外并沉積在糞便。12%的糞便固有細(xì)菌通過(guò)接合轉(zhuǎn)移攜帶了 RP4質(zhì)粒。喂食斑馬魚(yú)供體菌一段時(shí)間后停止,糞便中耐藥菌和耐藥基因排出的規(guī)律曲線(xiàn)可以分為上升,平臺(tái)和下降三段。3、后腸是耐藥菌和接合子定植,以及耐藥基因分布的最主要的消化道場(chǎng)所。4、斑馬魚(yú)腸道受體菌中非可培養(yǎng)細(xì)菌占90.4%～97.2%,其中最重要的接合子是Aeromonas,占90%以上。可培養(yǎng)細(xì)菌只占不到10%,主要包括Enterobacteriaceae和Shewanella。5、耐藥質(zhì)粒在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移和大量擴(kuò)增與調(diào)控基因在后腸的mRNA表達(dá)有關(guān)。后腸是耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率最高,最活躍的腸段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1495414