本文關(guān)鍵詞：日本沼蝦酚氧化酶原激活因子基因克隆及其表達(dá)分析　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：日本沼蝦(Macrobrachium nipponense),俗稱青蝦,屬于甲殼綱(Crustarcea)、十足目(Decaplda)、長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Palaemonidae),廣泛分布于我國(guó)多種淡水水域,是我國(guó)淡水蝦類養(yǎng)殖中一個(gè)重要的養(yǎng)殖品種。近年來,青蝦養(yǎng)殖中的病害問題日益凸顯,成為制約青蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素,亟待研究和解決。酚氧化酶原激活系統(tǒng)(Prophenoloxidaseactivating system,pro-PO)是無脊椎動(dòng)物先天免疫機(jī)制中最重要的組成部分。酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating Factor,PPAF)是酚氧化物酶原激活及其輔因子絲氨酸同系物活化的重要因子,可以直接影響酚氧化酶的活力和機(jī)體的免疫防御機(jī)制。這些免疫相關(guān)因子在抵御病原微生物入侵,以及參與機(jī)體免疫活動(dòng),一直倍受關(guān)注。本研究通過RACE方法首次克隆了日本沼蝦PPAF的cDNA全長(zhǎng)序列;通過半定量PCR技術(shù)分別對(duì)目的基因進(jìn)行了不同組織的表達(dá)譜分析,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下。通過RACE技術(shù)首次得到PPAF基因的cDNA全序列,全長(zhǎng)1261bp,包括364bp的5'UTR,822bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF),75bp的3'UTR。編碼區(qū)271個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量是30.389.86kDa,等電點(diǎn)為9.727,其中包含34個(gè)堿性氨基酸(K,R),18個(gè)酸性氨基酸(D,E),94個(gè)疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V),75個(gè)極性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)。開放閱讀框的組成分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其G、C堿基的含量(51.09%)高于A、T堿基的含量(48.91%)。分析日本沼蝦PPAF基因的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在84-277區(qū)域左右有一個(gè)胰蛋白酶功能域,在77-278區(qū)域中有一胰蛋白酶家族中的類絲氨酸蛋白功能域。構(gòu)建了進(jìn)化樹,分析表明日本沼蝦PPAF基因與中國(guó)對(duì)蝦的同源性最高,與家蠶、棉鈴蟲的同源性最低。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了PPAF基因在沼蝦體內(nèi)不同組織的差異表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果顯示,PPAF基因在健康的日本沼蝦的不同組織內(nèi)表達(dá)水平差異顯著(P0.05),在肝胰腺、鰓和血細(xì)胞等免疫相關(guān)的組織中的表達(dá)水平較高;而在肌肉、精巢、卵巢和甲殼等組織中的表達(dá)水平低。選取肝胰腺組織來檢測(cè)PPAF基因在沼蝦感染嗜水氣單胞菌后不同時(shí)期的表達(dá)量變化情況,以空白組的β-actin基因作標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)不同時(shí)期表達(dá)量變化規(guī)律。半定量PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在感染了嗜水氣單孢菌后的72h內(nèi),日本沼蝦的PPAF基因在肝胰腺、鰓、血細(xì)胞組織中的mRNA表達(dá)差異顯著(P0.05)。PO活性在攻毒組中變化明顯,在嗜水氣單胞菌刺激后,PO活性在注射3小時(shí)后增加到4.23倍,與生理鹽水注射組相比有顯著的提高。嗜水氣單胞菌注射后的PO活性的顯著變化現(xiàn)象表明,細(xì)菌可以觸發(fā)酚氧化酶原激活系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成PO,說明青蝦的酚氧化酶原系統(tǒng)可以抵御外界細(xì)菌的侵襲,表明酚氧化酶原系統(tǒng)在青蝦的免疫系統(tǒng)中起到著重要的作用。PPAF是日本沼蝦最重要的體液免疫系統(tǒng)proPO的關(guān)鍵性因子,在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中占有重要地位。本研究對(duì)PPAF基因在感染嗜水氣單胞菌后免疫組織中的表達(dá)規(guī)律的研究,揭示了日本沼蝦在對(duì)抗細(xì)菌性疾病的免疫防御中的遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ);進(jìn)一步揭示了酚氧化酶原激活系統(tǒng)參與免疫防御的遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:M.nipponense (Macrobrachium nipponense), commonly known as shrimp, belongs to Crustacea, Decapoda (Crustarcea) (Decaplda), Palaemonidae (Palaemonidae), Macrobrachium (Palaemonidae), is widely distributed in our country in a variety of fresh water, is one of the most important aquaculture species of Chinese freshwater shrimp aquaculture. In recent years, the disease of shrimp farming has become increasingly prominent, has become an important factor restricting the healthy development of shrimp aquaculture, need to be studied and solved. The prophenoloxidase activating system (Prophenoloxidaseactivating system pro-PO) is the most important part of invertebrate innate immune mechanisms in the matter. The prophenoloxidase activating factor (prophenoloxidase-activating, Factor, PPAF) is a phenolic oxide and its zymogen activation an auxiliary factor activated serine homologues, can directly affect the immune defense mechanism of phenol oxidase activity and the body's immune phase. These 鍏沖洜瀛愬湪鎶靛盡鐥呭師寰敓鐗╁叆渚，

本文編號(hào)：1363516