【摘要】：鈦合金具有良好的生物相容性,出色的抗腐蝕性能和機械性能,在骨損傷治療中得到了廣泛應用。但其表面惰性誘發(fā)多種臨床問題,需要對其表面進行功能化改性。microRNAs參與調控骨修復的各個過程,投遞成骨相關microRNAs已經被證明能夠有效促進骨愈合。因此,本文目的是設計一種microRNAs投遞系統(tǒng),實現體內穩(wěn)定有效的microRNA轉導,并對鈦合金表面進行修飾,實現體內促進骨再生的功能。本文首先以商用基因轉染劑分別將miR-21和反義miR-21(as-miR-21)轉染到臍帶血間充質干細胞(hUMSCs)中,研究miR-21促進hUMSCs成骨分化的能力及其機制。結果表明,hUMSCs內投遞miR-21可顯著提高成骨標志物堿性磷酸酶(ALP)、RUNT相關基因2(RUNX-2)和骨鈣素(OCN)的表達,茜素紅染色證明miR-21可促進hUMSCs成骨分化。本文同時證明,隨著miR-21的上游調控作用,PI3K-AKT信號通路得以激活,進而促進GSK-3β的磷酸化,使得β-catenin得以穩(wěn)定并入核后增加RUNX-2基因的表達,最終促進hUMSCs成骨分化。其次本文以原位聚合法制備了包載miRNA的納米微囊,進一步通過靜電作用與O-羧甲基殼聚糖(CMCS)復合,形成miRNA活化基質,避免了miRNA的漏出并且為細胞轉染提供了更好的穩(wěn)定性,同時活化基質具有良好的生物相容性。以此基質投遞miR-21至hUMSCs,ALP及RUNX-2的表達均呈上升趨勢,證明miR-21活化基質具有誘導干細胞成骨分化的能力。SD大鼠體內脛骨平臺骨損傷部位注射基質后,分別于2周和4周考察活化基質促進骨修復能力,結果表明:注射基質后,miR-21相關靶點蛋白PTEN下調,β-catenin上調。并且與對照組相比具有更好的促進骨再生能力第三,本文以miR-29b活化基質修飾鈦合金表面。該涂層不僅有利于細胞黏附以及增值,而且能夠提供較高的細胞轉染效率。此外,涂層可以調控miR-29b的靶點HDAC-4,并可體外誘導hUMSCs成骨分化。將miR-29b活化基質修飾的鈦合金植入大鼠脛骨平臺,分別在2周、4周、6周和8周考察鈦合金表面骨的修復能力,結果表明:鈦合金表面miR-29b涂層修飾后,能夠極大提高其表面骨缺損愈合能力。此外,成骨相關標志物RUNX-2和OCN的表達水平提高且miR-29b靶點HDAC-4的表達下調,進一步證明miR-29b功能化涂層修飾后,能夠極大提高鈦合金表面骨再生能力。
[Abstract]:Titanium alloys have been widely used in the treatment of bone injury because of their good biocompatibility, excellent corrosion resistance and mechanical properties. However, the surface inertia induces a variety of clinical problems and needs to be functionalized. MicroRNAs is involved in various processes of bone repair, and the delivery of osteoblast related microRNAs has been proved to be effective in promoting bone healing. Therefore, the aim of this paper is to design a microRNAs delivery system, to realize stable and effective microRNA transduction in vivo, and to modify the surface of titanium alloy to promote bone regeneration in vivo. In this paper, miR-21 and antisense miR-21 (as-miR-21) were transfected into umbilical cord blood mesenchymal stem cells (hUMSCs) by commercial gene transfer agent, respectively, to study the ability and mechanism of miR-21 to promote osteogenic differentiation of hUMSCs. The results showed that the expression of (ALP), RUNT related gene 2 (RUNX-2) and osteocalcin (OCN) was significantly increased by miR-21 in hUMSCs, and miR-21 could promote the differentiation of hUMSCs by alizarin red staining. We also demonstrated that with the upstream regulation of miR-21, the PI3K-AKT signaling pathway was activated, which promoted the phosphorylation of GSK-3 尾, and increased the expression of RUNX-2 gene after the stable incorporation of 尾-catenin into the nucleus. Finally, hUMSCs osteogenic differentiation was promoted. Secondly, nano-microcapsules coated with miRNA were prepared by in-situ polymerization. Furthermore, by electrostatic interaction with O-carboxymethyl chitosan (CMCS), the activated miRNA matrix was formed. It can avoid the leakage of miRNA and provide better stability for cell transfection, and the activated matrix has good biocompatibility. The expression of miR-21, hUMSCs,ALP and RUNX-2 in this medium was on the rise, which proved that miR-21 activated matrix had the ability to induce osteogenic differentiation of stem cells. After SD rats were injected with matrix at the site of tibial plateau bone injury in vivo, the expression of miR-21 activated matrix was found to be able to induce osteogenic differentiation of stem cells. The ability of activated matrix to promote bone repair was investigated at 2 and 4 weeks, respectively. The results showed that miR-21 related target protein PTEN was down-regulated and 尾-catenin upregulated after injection of matrix. Compared with the control group, the surface of titanium alloy was modified with miR-29b activated matrix. The coating can not only facilitate cell adhesion and proliferation, but also provide higher cell transfection efficiency. In addition, the coating can regulate the target HDAC-4, of miR-29b and induce hUMSCs osteogenic differentiation in vitro. Titanium alloy modified with miR-29b activated matrix was implanted into tibial plateau of rats. The repair ability of titanium alloy surface was investigated at 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks, respectively. The results showed that the surface of titanium alloy was modified by miR-29b coating. It can greatly improve the healing ability of the surface bone defect. In addition, the increased expression of RUNX-2 and OCN and the down-regulation of HDAC-4, the target of miR-29b, further proved that the ability of bone regeneration on the surface of titanium alloy could be greatly improved by the modification of miR-29b functionalized coating.
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TG178

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本文編號：2320875