本文關(guān)鍵詞：信號(hào)放大的乙腦病毒電化學(xué)交流阻抗免疫傳感器的研究

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【摘要】：自古至今,由病毒引起的疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康。其中,由庫蚊傳播的日本腦炎病毒(JEV)是引起疾病的最嚴(yán)重的病毒之一。它能夠侵害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng),進(jìn)而引起病毒性腦炎。它在臨床上以高熱、驚厥、意識(shí)障礙及腦膜刺激癥為主,病死率很高,且多數(shù)幸存者患有神經(jīng)、認(rèn)知和精神后遺癥。JEV感染主要在我國及亞洲的一些國家流行,是嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題之一。迄今尚無有效的抗病毒藥物,針對(duì)JEV感染引起的腦炎主要以支持和對(duì)癥治療為主。因此,建立一種快速、靈敏的JEV早期診斷方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。JEV感染人體后,在血液中病毒載量較低,經(jīng)過短暫的病毒血癥期后進(jìn)入腦組織,故需要建立一種高靈敏的方法用于JEV的快速檢測(cè)。電化學(xué)方法因其具有靈敏度高,易于小型化等特點(diǎn),在生物傳感器研究領(lǐng)域廣受關(guān)注。電化學(xué)交流阻抗技術(shù)以其對(duì)界面性質(zhì)敏感,免標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)受到電化學(xué)生物傳感器研究人員的青睞。本論文以抗體為分子識(shí)別物質(zhì),IgM和JEV為目標(biāo)物,利用辣根氧化物酶HRP作為標(biāo)記物進(jìn)行信號(hào)放大,開發(fā)了一種用于檢測(cè)IgM和JEV的高靈敏的電化學(xué)交流阻抗免疫傳感器。本論文由四章內(nèi)容構(gòu)成：第一章緒論本章首先概述了JEV研究背景,包括JEV生物學(xué)特性、致病機(jī)制、防治措施以及傳統(tǒng)的檢測(cè)方法；其次介紹了生物傳感器的原理和分類,其中詳細(xì)綜述了生物傳感器在病毒檢測(cè)中的研究；接著概述了電化學(xué)免疫傳感器的原理和分類,并重點(diǎn)介紹了電化學(xué)交流阻抗技術(shù)以及該技術(shù)在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用;隨后介紹了絲網(wǎng)印刷技術(shù)及其在病毒傳感器中的研究進(jìn)展;最后,闡述了本論文的選題背景、研究思路、研究目的以及研究?jī)?nèi)容。第二章信號(hào)放大的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)IgM的研究本研究制備了一種具有高靈敏度的檢測(cè)IgM的電化學(xué)交流阻抗免疫傳感器。當(dāng)目標(biāo)物IgM存在時(shí),利用三明治夾心法連接上辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記物。隨后在H202的條件下,標(biāo)記在抗體上HRP催化氧化4-氯-1-萘酚(CN),生成的不溶性沉淀附著在電極表面,阻礙了電子在電化學(xué)探針[Fe(CN)6]3/4-與電極表面的傳遞,進(jìn)而起到信號(hào)放大的作用。通過比較IgM結(jié)合前后阻抗值的變化來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物IgM的檢測(cè)。在濃度為1.6 fg/mL～1.6 ng/mL的范圍內(nèi),目標(biāo)物濃度和阻抗信號(hào)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限可達(dá)到0.53 fg/mL(S/N=3),并且該傳感器有較高的選擇性。第三章交流阻抗信號(hào)放大的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)JEV的研究本研究構(gòu)建了一種“三明治”型電化學(xué)病毒免疫傳感器。首先通過-SH自組裝的方式,在處理好的金電極上建立了小分子MUA(十一巰基十一烷酸)、MCH(巰基己醇)和DTT(二硫蘇糖醇)的混合單層。之后利用NHS/EDC活化MUA上的羧基,并和抗體上的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵,將1st anti-JEV固定在電極上。隨后利用免疫反應(yīng)把自制的JEV和2nd HRP-anti-JEV連接到電極上。在H202存在的條件下HRP催化氧化CN產(chǎn)生沉淀吸附在電極表面,使電極導(dǎo)電性降低。最后用電化學(xué)交流阻抗方法來檢測(cè)電極上沉淀物的積累,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物JEV的檢測(cè)及信號(hào)放大。該方法有很高的靈敏度和選擇性。第四章基于金納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極的電化學(xué)交流阻抗免疫傳感器檢測(cè)JEV的研究本研究以金納米粒子(AuNPs)修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)為基體電極,制備了一種便宜、高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器用于JEV的研究。首先,利用計(jì)時(shí)電位法在SPCE上電沉積一層AuNPs;之后通過-SH自組裝的方式,在金納米粒子上建立了小分子MUA、MCH和DTT的混合單層。之后再利用NHS/EDC活化MUA上的-COOH,并與anti-JEV上的-NH2發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵,將1 stanti-JEV固定在電極上。通過三明治夾心法將HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合到電極表面。最后HRP生物催化氧化CN產(chǎn)生不溶物沉淀,阻礙氧化還原電對(duì)與電極之間的電子傳遞,實(shí)現(xiàn)了JEV的高靈敏度檢測(cè)。在JEV濃度為500 pfu/mL-500000 pfu/mL范圍內(nèi),阻抗變化值與JEV的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,最低檢測(cè)限為167 pfu/mL(S/N=3),為JEV的檢測(cè)提供了一種低成本、高靈敏、選擇性好的方法。
【關(guān)鍵詞】：免疫傳感器 電化學(xué)交流阻抗 絲網(wǎng)印刷電極 JEV 信號(hào)放大
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第1章 緒論11-31
• 1.1 JEV概述11-15
• 1.1.1 JEV的生物學(xué)特性12
• 1.1.2 JEV的致病機(jī)制及臨床表現(xiàn)12-13
• 1.1.3 JEV的防治13
• 1.1.4 JEV傳統(tǒng)的檢測(cè)方法13-15
• 1.2 生物傳感器的概述15-21
• 1.2.1 生物傳感器的工作原理15-16
• 1.2.2 生物傳感器的分類16-17
• 1.2.3 生物傳感器在病毒檢測(cè)中的研究進(jìn)展17-21
• 1.3 電化學(xué)免疫傳感器的概述21-25
• 1.3.1 電化學(xué)免疫傳感器的原理21-22
• 1.3.2 電化學(xué)交流阻抗技術(shù)的概述22-24
• 1.3.3 電化學(xué)交流阻抗免疫傳感器在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用24-25
• 1.4 絲網(wǎng)印刷傳感器25-28
• 1.4.1 絲網(wǎng)印刷技術(shù)的概述25-26
• 1.4.2 絲網(wǎng)印刷技術(shù)在病毒傳感器中的應(yīng)用26-28
• 1.5 本論文的選題背景、研究思路、研究目的和研究?jī)?nèi)容28-31
• 第2章 信號(hào)放大的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)IgM的研究31-43
• 2.1 引言31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分32-35
• 2.2.1 試劑32-33
• 2.2.2 儀器33
• 2.2.3 電化學(xué)IgM免疫傳感器的制備33-35
• 2.3 結(jié)果與討論35-41
• 2.3.1 電化學(xué)IgM免疫傳感器的表征35-38
• 2.3.2 IgM免疫傳感器的原子力顯微鏡的表征38
• 2.3.3 電化學(xué)IgM免疫傳感器的線性范圍38-39
• 2.3.4 電化學(xué)IgM免疫傳感器的選擇性39-41
• 2.4 本章小結(jié)41-43
• 第3章 交流阻抗信號(hào)放大的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)JEV的研究43-53
• 3.1 引言43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分44-46
• 3.2.1 試劑44
• 3.2.2 儀器44
• 3.2.3 電化學(xué)JEV免疫傳感器的制備44-46
• 3.3 結(jié)果與討論46-52
• 3.3.1 電化學(xué)JEV免疫傳感器的交流阻抗法表征46-48
• 3.3.2 電化學(xué)JEV免疫傳感器的線性范圍48-50
• 3.3.3 電化學(xué)JEV免疫傳感器的選擇性50-52
• 3.4 結(jié)論52-53
• 第4章 基于金納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極的電化學(xué)交流阻抗免疫傳感器檢測(cè)JEV的研究53-69
• 4.1 引言53-54
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分54-58
• 4.2.1 試劑54-55
• 4.2.2 儀器55
• 4.2.3 絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)的制備55-56
• 4.2.4 AuNPs-SPCE的制備56
• 4.2.5 電化學(xué)JEV免疫傳感器的制備56-58
• 4.3 結(jié)果與討論58-68
• 4.3.1 印制的SPCE的形貌58
• 4.3.2 AuNPs-SPCE的電化學(xué)表征58-60
• 4.3.3 JEV免疫傳感器的交流阻抗表征60-62
• 4.3.4 電化學(xué)JEV免疫傳感器的條件優(yōu)化62-63
• 4.3.5 JEV免疫傳感器的原子力顯微鏡的表征63-64
• 4.3.6 電化學(xué)JEV免疫傳感器的線性范圍64-66
• 4.3.7 檢測(cè)JEV電化學(xué)免疫傳感器的選擇性66-68
• 4.4 本章小結(jié)68-69
• 總結(jié)69-71
• 參考文獻(xiàn)71-85
• 致謝85-87
• 攻讀碩士期間的研究成果87

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