發(fā)布時間：2017-08-01 07:11

  本文關鍵詞：木薯β-葡萄糖苷酶在畢赤酵母的表面展示及催化合成烷基糖苷的研究

  更多相關文章： 木薯β-葡萄糖苷酶 畢赤酵母GS115 全細胞催化劑 正辛基β-D-葡萄糖苷

【摘要】：烷基糖苷是一種“世界級”的“綠色”非離子表面活性劑。它具有表面張力小,起泡、分散、配伍性能好,去污能力優(yōu)秀,無毒,對皮膚的刺激性小,可以被生物降解,可以由再生材料制得等諸多優(yōu)點。普遍用于日化、農(nóng)業(yè)、印染、紡織及石油等領域。目前工業(yè)上采用化學法來合成,但化學法存在一些缺陷,比如沒有選擇性,反應沒有特異性,產(chǎn)物中會同時存在a和β異頭物,反應過程需要高溫高壓,產(chǎn)品色澤較深。這不利于烷基糖的分離純化,從而限制了其在食品藥品領域的應用。與化學法相比,酶法合成具有選擇性強、反應條件溫和、過程簡單等諸多優(yōu)點�；诮湍讣毎砻嬲故炯夹g將木薯β-葡萄糖苷酶(MEBGL)展示在GS115細胞表面,制備成全細胞催化劑。這種固定化酶的方法非常簡單、成本低,而且簡單處理后就可回收再利用,克服了游離酶難以分離純化和循環(huán)使用的缺點。全基因合成經(jīng)過密碼子優(yōu)化的木薯β-葡萄糖苷酶基因mebgl,通過PCR進行擴增。以實驗室原有質(zhì)粒pKCALB-GCWn(n=12,19,21,51,61)為基礎,構建重組質(zhì)粒pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)。將構建成功的重組質(zhì)粒經(jīng)電轉化轉入畢赤酵母GS115。篩選出重組表面展示畢赤酵母GS115/pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)。將上述重組表面展示酵母以甲醇誘導產(chǎn)酶,采用以pNPG為底物的比色法測定水解酶活。測定的最適條件為,溫度35℃;pH 6.0。GS115/pKMEBGL-GCWn(n=12,19,21,51,61)誘導168h后的最高水解酶活是0.56U/g(GCW21)。然后進行免疫熒光分析,熒光顯微鏡下可以觀察到重組表面展示酵母發(fā)出的綠色熒光。相對于陰性對照菌,重組表面展示酵母菌的流式細胞儀峰圖在X軸上存在著漂移。這都說明MEBGL已經(jīng)成功展示在酵母表面。選用合成活力相對較高的GS115/pKMEBGL-GCW21進行合成烷基糖苷的研究。首先對其酶學性質(zhì)進行評估。在底物濃度為10mM的情況下,對于pNPG,甲基-β-D-葡萄糖苷(MG),葡萄糖,纖維二糖和龍膽二糖五種底物來說。轉化率最高的是pNPG,達到了52%。MG的轉化率較低,僅為10%。該酶完全無法利用葡萄糖,纖維二糖,龍膽二糖合成烷基糖苷。以10mM的pNPG為底物,對于不同長度的受體脂肪醇來說,轉化率隨著碳鏈長度的增加而降低。正己醇的轉化率最高,為70%。正辛醇的轉化率比正己醇的稍低,為52%。十碳醇和十二碳醇,由于碳鏈過長,它們的轉化率很低,分別為18%和2%。然后,對全細胞催化劑GS115/pKMEBGL-GCW21以pNPG和正辛醇為底物經(jīng)轉糖苷反應合成正辛基葡萄糖苷(OG)進行了研究。對于溫度、pH值、酶粉添加量、含水量、底物濃度的單因素優(yōu)化結果為,溫度40℃,pH5.0,酶粉添加量0.05g,含水量50%,底物濃度30mM,轉化率接近100%。然后,將底物濃度提高到50mM,70mM,含水量從35%到70%。底物濃度為50mM,含水量為50%時的轉化率為74%。但隨著底物濃度的進一步升高,轉化率逐漸降低。當?shù)孜餄舛葹?0mM時,轉化率為37%。然后,進行三因素響應面實驗。三個因素分別為酶粉添加量,含水量,底物添加量。使用Design-Expert.8.05b軟件進行響應面實驗的設計及數(shù)據(jù)擬合。利用擬合良好的模型預測并經(jīng)實驗證實的最適反應條件是酶添加量為0.05g,底物濃度為30mM,含水量為50%。
【關鍵詞】：木薯β-葡萄糖苷酶 畢赤酵母GS115 全細胞催化劑 正辛基β-D-葡萄糖苷
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O647.2;Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 英文縮略詞表13-14
• 第一章：緒論14-33
• 1.1 烷基糖苷表面活性劑概述14-17
• 1.1.1 烷基糖苷簡介14-15
• 1.1.2 烷基糖苷的應用15-17
• 1.2 國內(nèi)外烷基糖苷合成研究進展17-22
• 1.2.1 烷基糖苷工業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀17-18
• 1.2.2 化學法合成烷基糖苷18-19
• 1.2.3 酶法合成烷基糖苷19-22
• 1.3 木薯β-葡萄糖苷酶概述22-29
• 1.3.1 β-葡萄糖苷酶簡介22-24
• 1.3.2 木薯β-葡萄糖苷酶概述24
• 1.3.3 木薯β-葡萄糖苷酶的催化機制24-26
• 1.3.4 木薯β-葡萄糖苷酶的催化性能26-29
• 1.4 畢赤酵母細胞表面展示29-30
• 1.4.1 畢赤酵母表面展示技術29-30
• 1.4.2 畢赤酵母表面展示MEBGL30
• 1.5 立題背景及意義30-33
• 1.5.1 立題背景30-31
• 1.5.2 立題意義31
• 1.5.3 本論文主要研究內(nèi)容31-33
• 第二章：MEBGL的畢赤酵母表達菌株構建及分析33-55
• 2.1 引言33-34
• 2.2 實驗材料34-38
• 2.2.1 實驗試劑34-35
• 2.2.2 實驗設備35-36
• 2.2.3 培養(yǎng)基與溶液的配制36-38
• 2.3.3.1 培養(yǎng)基的配制36-37
• 2.3.3.2 溶液的配制37-38
• 2.3 實驗方法38-46
• 2.3.1 重組質(zhì)粒pKMEBGL-GCW21的構建38-42
• 2.3.1.1 PCR引物的設計38
• 2.3.1.2 目的基因的PCR擴增及回收純化38-39
• 2.3.1.3 從大腸桿菌中提取質(zhì)粒pPIC9K39
• 2.3.1.4 質(zhì)粒與目的基因的雙酶切與回收純化39-40
• 2.3.1.5 重組質(zhì)粒pPIC9k/MEBGL-GCWn (n=12,19,21,51,61）的構建40
• 2.3.1.6 重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞40-41
• 2.3.1.7 重組子的PCR驗證和測序鑒定41-42
• 2.3.2 重組畢赤酵母菌株的構建和篩選42-46
• 2.3.2.1 重組質(zhì)粒的線性化及純化42
• 2.3.2.2 制備畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞42-43
• 2.3.2.3 電擊轉化畢赤酵母43
• 2.3.2.4 重組畢赤酵母菌株的篩選和鑒定43-44
• 2.3.2.5 陽性重組菌中木薯β-葡萄糖苷酶的甲醇誘導表達44
• 2.3.2.6 MEBGL水解酶活力測定44-45
• 2.3.4.7 重組畢赤酵母菌株的免疫熒光標記處理及檢測45-46
• 2.3.4.8 重組畢赤酵母菌株的催化性能比較46
• 2.4 結果與討論46-53
• 2.4.1 木薯β-葡萄糖苷酶重組質(zhì)粒的構建46-48
• 2.4.2 重組畢赤酵母表面展示菌株的構建及篩選48-49
• 2.4.3 重組畢赤酵母表面展示菌株的甲醇誘導表達49-51
• 2.4.4 重組畢赤酵母表面展示菌株的免疫熒光分析51-52
• 2.4.5 酵母細胞表面展示β-葡萄糖苷酶畢赤酵母催化性能分析52-53
• 2.5 本章小結53-55
• 第三章 畢赤酵母表面展示MEBGL轉糖苷合成烷基糖苷55-73
• 3.1 引言55
• 3.2 材料55
• 3.2.1 實驗試劑55
• 3.2.2 實驗儀器55
• 3.3 實驗方法55-59
• 3.3.1 畢赤酵母展示MEBGL全細胞催化劑的制備55-56
• 3.3.2 高效液相色譜HPLC-ELSD測定MEBGL的轉糖苷合成活力56
• 3.3.3 高效液相色譜HPLC-ELSD定量分析烷基糖苷56-57
• 3.3.4 畢赤酵母表面展示MEBGL合成性質(zhì)評估57
• 3.3.5 畢赤酵母表面展示MEBGL轉糖苷合成OG的單因素優(yōu)化57-59
• 3.3.6 畢赤酵母表面展示MEBGL轉糖苷合成OG的進一步優(yōu)化59
• 3.3.6.1 高底物濃度和含水量對反應的影響59
• 3.3.6.2 響應面優(yōu)化實驗59
• 3.4 結果與討論59-72
• 3.4.1 高效液相色譜HPLC-ELSD定量分析烷基糖苷59-60
• 3.4.2 畢赤酵母表面展示MEBGL合成性質(zhì)研究60-62
• 3.4.3 2mL體系中單因素條件對轉糖苷合成OG的影響62-66
• 3.4.4 2mL體系高水含量和高底物濃度條件下轉糖苷合成OG66-68
• 3.4.5 2mL體系中轉糖苷合成OG的響應面優(yōu)化68-72
• 3.5 本章小結72-73
• 結論與展望73-76
• 結論73-74
• 展望74-75
• 本文的創(chuàng)新之處75-76
• 參考文獻76-82
• 攻讀碩士學位期間取得的研究成果82-83
• 致謝83-84
• 附表84

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本文編號：603014