細胞膜作為細胞與外界的屏障,在維持細胞的穩(wěn)定、物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導等過程中發(fā)揮著非常重要的作用。細胞膜結(jié)構(gòu)和膜組成分子的異常化是許多疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。因此,解析細胞膜表面分子的分布及組裝機理對于理解其生理功能及病理過程至關(guān)重要。為了在亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)實現(xiàn)對生物分子分布的認知,直接觀測是最有效便捷的方法。然而,這些分子的尺寸大多數(shù)在衍射極限以下,普通光學顯微鏡不能滿足要求。近年來發(fā)展的超分辨熒光顯微技術(shù)突破了光學衍射極限,在研究細胞膜分布、解析生物結(jié)構(gòu)、揭示分子相互作用等方面做出了巨大貢獻。其中,直接隨機光學重構(gòu)顯微鏡(direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,dSTORM)由于較高的分辨率和便捷的操作而得到廣泛應(yīng)用。dSTORM技術(shù)基于單個熒光分子的定位,需要成千上萬張原始圖片來重構(gòu)一張超分辨圖像,因此,超分辨圖像的質(zhì)量與獲得的定位點密度和定位精度密切相關(guān)。為了獲得更準確的超分辨圖像,需要探針的精確定位和高密度識別。理想的探針應(yīng)該是小尺寸、單價態(tài)、高特異性以及對靶標較小的干擾。傳統(tǒng)的探針,例如抗體,尺寸相對較大且為多價態(tài),在識別...

【文章頁數(shù)】：155 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 超分辨熒光成像技術(shù)
        1.1.1 普通光學顯微鏡的分辨極限
        1.1.2 常見超分辨成像技術(shù)的類型
        1.1.3 超分辨顯微鏡的應(yīng)用及發(fā)展
    1.2 常規(guī)超分辨成像的熒光探針
        1.2.1 熒光蛋白
        1.2.2 熒光染料
    1.3 新型小分子熒光標記探針
        1.3.1 基因表達探針
        1.3.2 非基因表達探針
        1.3.3 有機合成探針
    1.4 小分子熒光標記在超分辨成像中的應(yīng)用
        1.4.1 生物正交反應(yīng)
        1.4.2 活細胞超分辨成像
        1.4.3 單分子示蹤
    1.5 本論文研究目的和意義
第2章 適配體標記用于細胞膜糖分子GalNAc的超分辨成像
    2.1 引言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2.2 玻片清洗
        2.2.3 凝集素連接熒光染料
        2.2.4 適配體染色
        2.2.5 超分辨樣品的制備
        2.2.6 超分辨成像
        2.2.7 定位精度的測量
        2.2.8 SR-Tesseler簇分析方法
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 適配體標記用于GalNAc的超分辨成像
        2.3.2 適配體探針與凝集素探針的定位精度
        2.3.3 SR-Tesseler方法分析GalNAc在細胞膜上形成的簇
        2.3.4 適配體探針的特異性
    2.4 本章小結(jié)
第3章 適配體標記用于研究癌癥相關(guān)分子globo H的分布特征
    3.1 引言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 細胞培養(yǎng)
        3.2.2 凝集素與染料的連接
        3.2.3 適配體標記
        3.2.4 超分辨樣品的制備
        3.2.5 超分辨成像
        3.2.6 Hopkins統(tǒng)計的隨機性檢驗
        3.2.7 基于坐標的共定位分析
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 適配體標記的globo H在MCF-7細胞膜上的超分辨成像
        3.3.2 定量分析globo H形成的簇
        3.3.3 Globo H在癌細胞和非癌細胞上的分布
        3.3.4 Globo H與其他癌癥相關(guān)糖分子的分布關(guān)系
    3.4 本章小結(jié)
第4章 小分子肽標記用于研究細胞膜EpCAM蛋白的組裝機理
    4.1 引言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 細胞培養(yǎng)
        4.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
        4.2.3 siRNA敲除CD9
        4.2.4 抗體和小分子肽標記
        4.2.5 超分辨樣品的制備
        4.2.6 超分辨成像
        4.2.7 圖像重構(gòu)
        4.2.8 FRC分辨率測量
        4.2.9 SR-Tesseler簇分析
        4.2.10 簇到簇距離的測量
        4.2.11 對相關(guān)函數(shù)分析
        4.2.12 CBC共定位分析
        4.2.13 互相關(guān)函數(shù)共定位分析
        4.2.14 基于鑲嵌的共定位分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 小分子肽標記用于EpCAM超分辨成像
        4.3.2 定量分析EpCAM蛋白簇
        4.3.3 EpCAM蛋白簇部分共定位于四跨膜蛋白CD9微區(qū)
        4.3.4 肌動蛋白骨架與糖基化影響EpCAM蛋白的聚集
    4.4 本章小結(jié)
第5章 適配體AS1411用于核仁素的超分辨成像
    5.1 引言
    5.2 實驗部分
        5.2.1 細胞培養(yǎng)
        5.2.2 抗體與染料的連接
        5.2.3 適配體標記
        5.2.4 抗體標記
        5.2.5 超分辨樣品的制備
        5.2.6 超分辨成像
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 適配體AS1411用于超分辨成像
        5.3.2 不同細胞組分NCL分布的差異
        5.3.3 癌細胞和正常細胞NCL分布的比較
    5.4 本章小結(jié)
第6章 抑制劑探針用于研究PSMA在細胞膜上的分布模式
    6.1 引言
    6.2 實驗部分
        6.2.1 細胞培養(yǎng)
        6.2.2 染料與抗體連接
        6.2.3 樣品制備
        6.2.4 超分辨成像
        6.2.5 圖像重構(gòu)
        6.2.6 共定位分析
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 抑制劑探針用于PSMA的超分辨成像
        6.3.2 抑制劑探針與抗體探針標記的比較
        6.3.3 定量分析PSMA簇
        6.3.4 PSMA簇與葉酸受體(FR)共定位關(guān)系
    6.4 本章小結(jié)
第7章 論文總結(jié)
參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文與取得的其他研究成果



本文編號：3826369