DNA邏輯門無酶信號放大傳感分析方法的構建和檢測miRNA的應用
發(fā)布時間：2021-12-16 07:58
小分子核糖核酸（miRNA）是一種進化保守的家庭內生19-22元長非編碼RNA,參與轉錄后的調控以及參與細胞的分化、增殖、凋亡、代謝,在多種生理和病理過程的作用是實現(xiàn)重大疾病的精準早期診斷和預后基因治療。本論文工作采用表面增強拉曼檢測技術（Surface-enhanced Raman scattering,SERS）,以微流控芯片為集成平臺將DNA無酶信號放大方法引入DNA邏輯門中,構建了新型功能化DNA無酶信號放大邏輯系統(tǒng),實現(xiàn)了一系列邏輯運算,并將邏輯運算應用于miRNA的檢測中,實現(xiàn)了高靈敏高選擇性的miRNA檢測在此基礎上,進一步將靶引發(fā)級聯(lián)反應DNA機器引入邏輯門運算中,設計了新型的級聯(lián)反應DNA納米機器邏輯門平臺,結合SERS和熒光技術,對腫瘤細胞中的miRNA進行雙模式信號成像分析并實現(xiàn)沉默基因的輸出和治療。本論文包括以下兩個部分:（1）采用SERS技術和DNA無酶信號放大技術,以微流控芯片為集成平臺,本論文構建了一種新型功能化DNA無酶信號放大邏輯系統(tǒng)。在邏輯門轉換單元中構建了一種以折扇型結構為主體的置換反應區(qū),首次引入了無酶鏈替代循環(huán)反應,提高反應信號響應。在此基礎上...
【文章來源】：青島科技大學山東省
【文章頁數】：89 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
原位滾動環(huán)轉錄同步機制（RCTsm）檢測miRNA原理圖[36]
DNA邏輯門無酶信號放大傳感分析方法的構建和檢測miRNA的應用4圖1-1原位滾動環(huán)轉錄同步機制（RCTsm）檢測miRNA原理圖[36]Figure1-1SchematicdiagramofmiRNAdetectionbyinsiturollingringtranscriptionsynchronizationmechanism(RCTsm)[36]Pan等人[37]將鎖核酸（LNA）修飾的DNA探針固定在磁珠上，并通過選擇性雜交和隨后的磁分離測試從樣品基質中分離目標miRNA。此外，LNA修飾的探針顯示出高的核酸酶抗性，適用于復雜樣品分析。為了提高檢測靈敏度，引入了聚合酶輔助的miRNA聚腺苷酸化的信號放大，設計了通過甲酸水解擴展的靶標miRNA和HPLC-FD測定游離腺嘌呤的方法。該方法可以對生物學樣品（即牛血清和細胞裂解液）中的miRNA-21進行定量檢測。圖1-2基于信號開啟策略的HPLC-FD定量分析miRNA[37]。Figure1-2QuantitativeassayofmiRNAsbyHPLC-FDbasedonasignal-onstrategy[37].MiRNA對于轉錄后基因調控至關重要。Zhang等人[38]合成了一種新型的雙二茂鐵生物標志物，將其放置在發(fā)夾DNA的兩端，從而產生了高效擴增信號的探針。開發(fā)了基于CHA和雙二茂鐵的雙擴增miRNA電化學生物傳感器。首先將Au電極固定在DNA1（H1）
青島科技大學研究生學位論文5上。然后，靶標miRNA與H1雜交以打開其發(fā)夾結構，并暴露隱藏序列以進一步補充H2。發(fā)夾DNA結構（H2）在DNA序列的5"和3"末端具有兩個雙二茂鐵單元。作為進一步的H2雜交的結果，靶從H1靶的雙鏈結構轉移并用于隨后的雜交，導致大量的H2-H1雙鏈結構附著在Au電極表面上。因此，在H2的5"末端標記的越來越多的雙二茂鐵接近Au電極。此外，由于H2的3"端存在大量未雜交的T堿基，固定在H2的3"末端的雙二茂鐵也靠近Au電極。該電化學生物傳感器以高特異性擴增實行了miRNA的檢測。圖1-3基于催化發(fā)夾裝配和新型雙二茂鐵標記的miRNA檢測電化學生物傳感器[38]。Figure1-3TheelectrochemicalbiosensorbasedoncatalytichairpinassemblyandnovelbisferrocenelabelingformiRNAdetection[38].He等人[39]提出了一種非標記和KF輔助的雙鏈延伸信號擴增手段，用于靈敏地檢測miRNA-155。靶標miRNA-155序列與發(fā)夾探針雜交，以在另一個發(fā)夾和部分雙鏈體的輔助下觸發(fā)兩個隨后的鏈延伸反應，并與KF酶和dNTPs共存。這導致形成大量G-四鏈體序列，這些序列可以與ThT染料結合，提高熒光強度，從而實現(xiàn)對miRNA-155的高度靈敏檢測。與其他方法相比，該方法具有兩個明顯的優(yōu)勢。首先，未經修飾的核酸探針用于實現(xiàn)miRNA的完全非標記檢測。第二，兩條鏈延伸回收利用含義的整合顯示了檢測fM水平的miRNA-155的高靈敏度。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Enzyme-free and multiplexed micro RNA detection using micro RNA-initiated DNA molecular motor[J]. Hui Wang,Honghong Wang,Chenghui Liu,Xinrui Duan,Zhengping Li. Science China（Chemistry）. 2016(01)
本文編號：3537782
【文章來源】：青島科技大學山東省
【文章頁數】：89 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
原位滾動環(huán)轉錄同步機制（RCTsm）檢測miRNA原理圖[36]
DNA邏輯門無酶信號放大傳感分析方法的構建和檢測miRNA的應用4圖1-1原位滾動環(huán)轉錄同步機制（RCTsm）檢測miRNA原理圖[36]Figure1-1SchematicdiagramofmiRNAdetectionbyinsiturollingringtranscriptionsynchronizationmechanism(RCTsm)[36]Pan等人[37]將鎖核酸（LNA）修飾的DNA探針固定在磁珠上，并通過選擇性雜交和隨后的磁分離測試從樣品基質中分離目標miRNA。此外，LNA修飾的探針顯示出高的核酸酶抗性，適用于復雜樣品分析。為了提高檢測靈敏度，引入了聚合酶輔助的miRNA聚腺苷酸化的信號放大，設計了通過甲酸水解擴展的靶標miRNA和HPLC-FD測定游離腺嘌呤的方法。該方法可以對生物學樣品（即牛血清和細胞裂解液）中的miRNA-21進行定量檢測。圖1-2基于信號開啟策略的HPLC-FD定量分析miRNA[37]。Figure1-2QuantitativeassayofmiRNAsbyHPLC-FDbasedonasignal-onstrategy[37].MiRNA對于轉錄后基因調控至關重要。Zhang等人[38]合成了一種新型的雙二茂鐵生物標志物，將其放置在發(fā)夾DNA的兩端，從而產生了高效擴增信號的探針。開發(fā)了基于CHA和雙二茂鐵的雙擴增miRNA電化學生物傳感器。首先將Au電極固定在DNA1（H1）
青島科技大學研究生學位論文5上。然后，靶標miRNA與H1雜交以打開其發(fā)夾結構，并暴露隱藏序列以進一步補充H2。發(fā)夾DNA結構（H2）在DNA序列的5"和3"末端具有兩個雙二茂鐵單元。作為進一步的H2雜交的結果，靶從H1靶的雙鏈結構轉移并用于隨后的雜交，導致大量的H2-H1雙鏈結構附著在Au電極表面上。因此，在H2的5"末端標記的越來越多的雙二茂鐵接近Au電極。此外，由于H2的3"端存在大量未雜交的T堿基，固定在H2的3"末端的雙二茂鐵也靠近Au電極。該電化學生物傳感器以高特異性擴增實行了miRNA的檢測。圖1-3基于催化發(fā)夾裝配和新型雙二茂鐵標記的miRNA檢測電化學生物傳感器[38]。Figure1-3TheelectrochemicalbiosensorbasedoncatalytichairpinassemblyandnovelbisferrocenelabelingformiRNAdetection[38].He等人[39]提出了一種非標記和KF輔助的雙鏈延伸信號擴增手段，用于靈敏地檢測miRNA-155。靶標miRNA-155序列與發(fā)夾探針雜交，以在另一個發(fā)夾和部分雙鏈體的輔助下觸發(fā)兩個隨后的鏈延伸反應，并與KF酶和dNTPs共存。這導致形成大量G-四鏈體序列，這些序列可以與ThT染料結合，提高熒光強度，從而實現(xiàn)對miRNA-155的高度靈敏檢測。與其他方法相比，該方法具有兩個明顯的優(yōu)勢。首先，未經修飾的核酸探針用于實現(xiàn)miRNA的完全非標記檢測。第二，兩條鏈延伸回收利用含義的整合顯示了檢測fM水平的miRNA-155的高靈敏度。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Enzyme-free and multiplexed micro RNA detection using micro RNA-initiated DNA molecular motor[J]. Hui Wang,Honghong Wang,Chenghui Liu,Xinrui Duan,Zhengping Li. Science China（Chemistry）. 2016(01)
本文編號：3537782
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