【摘要】：近些年來(lái),生物技術(shù)的快速發(fā)展極大的推動(dòng)了生命科學(xué)和分析化學(xué)學(xué)科的發(fā)展。其中核酸放大技術(shù)作為分子生物學(xué)中的一項(xiàng)重要技術(shù),因具有較高的靈敏度和較快的反應(yīng)速率,備受研究者的青睞,被廣泛應(yīng)用于生物分析、臨床診斷等領(lǐng)域。但是,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的實(shí)時(shí)、快速、靈敏檢測(cè)仍然是科研工作者追求的目標(biāo)。本論文基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù),建立了幾種新型的LAMP方法用于microRNA、尿嘧啶-DNA糖基化酶活性、單核苷酸多態(tài)性以及致病菌基因的檢測(cè)。本論文建立的方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度高以及特異性好等優(yōu)點(diǎn)。具體內(nèi)容如下:MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈RNA,在基因調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用,發(fā)展一種準(zhǔn)確、高效的miRNA檢測(cè)方法具有重要的意義。在第2章中,構(gòu)建了一種基于連接的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Ligation-LAMP)方法用于miRNA的高靈敏檢測(cè)。首先,將目標(biāo)miRNA反轉(zhuǎn)錄成其互補(bǔ)DNA序列cDNA;然后,在連接酶的輔助作用下,以cDNA為模板連接兩條發(fā)夾探針,產(chǎn)生一個(gè)雙啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA分子;雙啞鈴結(jié)構(gòu)DNA作為L(zhǎng)AMP循環(huán)反應(yīng)的引發(fā)物引發(fā)放大反應(yīng),最終產(chǎn)生大量的長(zhǎng)度不一的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)DNA,利用SYBR Green I對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行染色,產(chǎn)生熒光增強(qiáng)信號(hào)。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線,達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)miRNA的目的。與傳統(tǒng)的LAMP方法相比,該方法的獨(dú)特之處在于將高保真的Taq DNA連接酶引入LAMP反應(yīng)用于產(chǎn)生雙啞鈴結(jié)構(gòu)DNA,進(jìn)而引發(fā)LAMP循環(huán)擴(kuò)增。Taq DNA連接酶的引入使得本方法具有很好的單堿基錯(cuò)配識(shí)別能力。此外,該方法可以實(shí)現(xiàn)從1 fM到1 nM濃度范圍內(nèi)miRNA的定量檢測(cè),檢測(cè)下限為0.2 fM,可以用于復(fù)雜樣品中miRNA的檢測(cè)。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)參與DNA的堿基切除修復(fù)過(guò)程,是一種重要的DNA糖基化酶,在保持基因完整方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在第3章中,基于莖-環(huán)引物介導(dǎo)的指數(shù)放大(SPEA)反應(yīng)發(fā)展了一種無(wú)需標(biāo)記的高靈敏方法用于UDG的活性檢測(cè)。首先,UDG剪切掉輔助發(fā)夾探針HP上的尿嘧啶堿基產(chǎn)生一個(gè)脫堿基位點(diǎn)。這個(gè)脫堿基位點(diǎn)可以被溶液中存在的核酸內(nèi)切酶IV切割,釋放出一條單鏈DNA序列。這條單鏈DNA序列進(jìn)而引發(fā)與另外兩條發(fā)夾探針H1和H2之間的鏈置換反應(yīng),產(chǎn)生一個(gè)雙啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA分子,進(jìn)而引發(fā)LAMP反應(yīng)的循環(huán)放大步驟,產(chǎn)生大量的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)DNA產(chǎn)物。利用雙鏈特異性染料SYBR Green I對(duì)DNA產(chǎn)物進(jìn)行染色,產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光曲線,實(shí)現(xiàn)對(duì)UDG活性的分析測(cè)定。本方法采用SYBR Green I作為信號(hào)分子,無(wú)需熒光基團(tuán)標(biāo)記,檢測(cè)成本較低,可以實(shí)現(xiàn)1 mU/mL到1 U/mL濃度范圍內(nèi)UDG的活性檢測(cè),檢測(cè)下限低至0.68 mU/mL,并且在實(shí)際體系中具有良好的檢測(cè)性能。另外,本方法還可以用于UDG抑制劑的測(cè)定。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上,發(fā)生在基因編碼區(qū)的SNP與許多疾病有關(guān),因此SNP的檢測(cè)對(duì)臨床診斷和疾病治療具有十分重要的意義。在第4章中,將具有單堿基識(shí)別能力的RNase H2酶引入到環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法中,發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、高效的引物激活LAMP(PA-LAMP)方法用于SNP的特異性檢測(cè)。設(shè)計(jì)一條單堿基錯(cuò)配識(shí)別探針BIP,在靠近其3’端修飾一個(gè)和突變目標(biāo)互補(bǔ)的RNA堿基,并且在3’末端修飾一個(gè)C3 spacer以防止聚合酶的延伸。當(dāng)突變目標(biāo)存在時(shí),BIP和目標(biāo)DNA在RNA堿基位置完全互補(bǔ),RNase H2酶切斷RNA堿基上游的磷酸二酯鍵,產(chǎn)生一個(gè)帶有羥基的3’末端,激活BIP作為引物引發(fā)LAMP反應(yīng)的放大步驟。在此放大反應(yīng)中,由于BIP需要被RNase H2酶切割才能被聚合延伸,所以SNP可以被反復(fù)識(shí)別,這大大提高了本方法的選擇性。該方法可以達(dá)到近10000倍的錯(cuò)配區(qū)分率,可以檢測(cè)到濃度低至22 aM的突變目標(biāo),并且能夠用于實(shí)際基因組樣品中SNP的檢測(cè)。第5章中,建立了一種基于PA-LAMP方法的艱難梭菌和嗜肺軍團(tuán)菌雙重檢測(cè)策略。首先針對(duì)兩種目標(biāo)的致病基因序列分別設(shè)計(jì)一套高效的引物,在靠近FIP的3’端修飾一個(gè)RNA堿基,作為RNase H2酶的識(shí)別位點(diǎn)。然后在此RNA堿基的兩側(cè)分別標(biāo)記一個(gè)熒光團(tuán)和一個(gè)淬滅團(tuán),其中艱難梭菌和嗜肺軍團(tuán)菌的FIP分別標(biāo)記不同熒光團(tuán)。當(dāng)與其引物對(duì)應(yīng)的目標(biāo)序列存在時(shí),RNase H2酶就會(huì)循環(huán)切割并激活含有RNA堿基的FIP引物引發(fā)LAMP反應(yīng),熒光恢復(fù)產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)的熒光信號(hào),通過(guò)測(cè)定這兩種熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)熒光曲線,實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種致病菌的同時(shí)檢測(cè)。該方法不僅具有較好的靈敏度和特異性,并且可以用于細(xì)菌基因組提取樣品中艱難梭菌和嗜肺軍團(tuán)菌的同時(shí)檢測(cè),為L(zhǎng)AMP方法的進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

LAMP反應(yīng)的原理示意圖

增加兩條環(huán)引物的LAMP反應(yīng)的原理示意圖
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657.3;Q503

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本文編號(hào)：2655611