【摘要】：生物分子(核酸、蛋白質、酶、細胞、組織和生物小分子等)的簡單、快速及高效靈敏檢測在疾病診斷、食品藥品分析、環(huán)境監(jiān)測和科學研究等方面具有十分重要的意義。隨著社會發(fā)展的需要,完善和發(fā)展操作更加簡單、靈敏度更高、特異性更強以及檢測通量更高的生物傳感技術已成為生物分析領域的一個研究熱點。本論文首先立足簡化實驗操作步驟、提高檢測靈敏度和特異性地需求,借助等溫酶輔助信號放大技術和DNA催化自組裝信號放大技術發(fā)展了新穎的可視化及熒光生物傳感體系并應用于核酸和蛋白質分子的靈敏檢測。并通過對實際樣品(血清及細胞裂解液)中生物分子的分析檢測,驗證了這些方法的可行性、可靠性及適用性。為了進一步深入研究單細胞內多個RNA目標物地表達及空間分布信息,本研究采用DNA四面體納米結構及原位滾環(huán)擴增技術(RCA)分別對單細胞內兩種重要RNA的分布及表達情況進行了同時熒光成像分析,并對其相應的檢測機理及檢測性能做了深入研究和探索。這些研究方法在檢測靈敏度、選擇性、適用性以及檢測通量等方面都取得了良好的實驗結果。具體的研究工作歸納為以下幾個部分:1.二次循環(huán)信號放大策略免標記靈敏可視化檢測HIV DNA近年來,可視化檢測越來越受到廣大研究者地關注和青睞,因為可視化檢測方法無需使用任何特殊先進儀器即可實現(xiàn)目標生物分子的快速檢測。然而,使用可視化方法實現(xiàn)痕量生物分子的檢測并達到與PCR方法相媲美的檢測靈敏度仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。本研究基于核酸外切酶III(Exo III)輔助的DNA循環(huán)和功能化DNA酶(辣根過氧化物模擬酶),發(fā)展了一種新型的二次循環(huán)信號放大策略用于目標物HIV DNA的靈敏可視化檢測。當有目標物HIV DNA存在時,在Exo III的輔助下可引發(fā)兩個獨立且同時進行的DNA循環(huán)過程。該二次循環(huán)信號放大過程使得G-四倍體序列鎖定的兩個DNA發(fā)卡型探針被識別催化水解并最終釋放出大量自由的G-四倍體序列,這些G-四倍體序列可以和Hemin結合生成G-四倍體/Hemin辣根過氧化物模擬酶并催化溶液由無色轉變?yōu)榫G色,通過溶液顏色地改變實現(xiàn)對目標物HIV DNA低至2.5 pmol L~(-1)的靈敏可視化檢測。該可視化檢測方法采用未修飾DNA發(fā)卡型探針,避免了任何復雜和昂貴信號轉導儀器地使用,因此在本質上非常簡單和經(jīng)濟。此外,該可視化檢測方法也展現(xiàn)出良好的單堿基錯配識別能力。通過合理的探針設計,該方法可被拓展應用于其它DNA生物標志物的靈敏可視化檢測。2.目標物引發(fā)二次循環(huán)信號放大策略免標記靈敏可視化檢測細胞因子基于脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)探針的可視化生物檢測方法由于其簡單的檢測機理近年來引起廣大研究者們的濃厚興趣。然而,要進一步提升該可視化檢測方法的靈敏度并將其應用范圍拓展到其它非核酸目標物的檢測仍然面臨著兩個重大挑戰(zhàn)。在本研究體系中,我們巧妙設計了一個DNA發(fā)卡型適配體DNA酶探針并基于該發(fā)卡型探針發(fā)展了一個新的二次循環(huán)信號放大策略應用于細胞因子的靈敏可視化檢測。當出現(xiàn)目標物細胞因子(干擾素γ,IFN-γ)時,目標物IFN-γ可與DNA發(fā)卡型探針的適配體序列特異性結合并將其打開,此時溶液中已經(jīng)存在的Bst-聚合酶和λ核酸外切酶可以協(xié)助實現(xiàn)目標物IFN-γ和一段DNA中間目標物的同時循環(huán)并達到二次循環(huán)信號放大的效果。經(jīng)過該二次循環(huán)放大過程溶液中產(chǎn)生了大量的G四倍體序列,并可結合氯化血紅素(Hemin)生成大量G-四倍體/Hemin辣根過氧化物模擬酶(DNA酶),該模擬酶可催化無色的ABTS~(2-)變?yōu)榧由畹木G色并以此實現(xiàn)對目標物IFN-γ的可視化高靈敏檢測,裸眼檢測限可以低至50 pmol L~(-1)。再者,該可視化檢測方法對目標物IFN-γ具有高度的選擇性,在均相溶液中使用未修飾的適配體DNA酶探針即可實現(xiàn)目標物的可視化檢測。鑒于該方法所具備的獨特優(yōu)點,我們通過對檢測探針的合理再設計即可開發(fā)新的檢測平臺并實現(xiàn)對其它生物分子地檢測。3.RNA誘導催化自組裝DNA納米結構實現(xiàn)癌細胞中miRNA的高靈敏檢測近年來,微小RNA(miRNA)被作為一種新型的腫瘤標志物應用于癌癥的早期檢測及相關研究。由于miRNA序列較短、家族同源序列相似度高、表達含量低和易降解等本質特征,使得miRNA的高特異性準確定量分析變得復雜。在本研究中,以癌細胞中特異性表達的miRNA-21為引發(fā)劑,借助等溫足點介導的鏈置換反應催化DNA發(fā)卡型探針級聯(lián)組裝形成“煙花狀”DNA納米結構并以此實現(xiàn)miRNA-21的熒光靈敏檢測。由于DNA納米結構自組裝過程中引發(fā)劑miRNA-21被循環(huán)再利用,因此少量的目標物miRNA-21可誘導催化自組裝形成大量的DNA納米結構并實現(xiàn)熒光檢測信號的放大。本研究采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了DNA納米結構的自組裝過程及自組裝時間對DNA納米結構構型的影響。miRNA-21引發(fā)DNA納米結構自組裝技術作為一種新型的信號放大策略實現(xiàn)了目標物miRNA-21的超靈敏熒光檢測。實現(xiàn)了人乳腺癌細胞(MCF-7)中miRNA-21的熒光靈敏檢測,并可檢測到低至10個癌細胞。因此,本研究工作為DNA納米結構在各種癌癥早期診斷中的應用提供了技術支持和新的機會。4.多色熒光編碼可變構DNA納米結構實現(xiàn)活細胞內多個miRNAs的同時檢測近年來,金納米顆粒和石墨烯被廣泛應用于生物體內的分析研究,但在實際操作中這些納米材料往往需要復雜的制備過程和繁瑣的功能化步驟。同時這些無機材料自身的生物毒性使其在生物體內的實際應用方面一直存在著很大地爭議。在本研究工作中,我們利用DNA良好的生物相容性、無毒性和可控性等方面的顯著優(yōu)勢,構建了一個可重構、多色熒光編碼DNA四面體納米結構并將其應用于活細胞內多個miRNAs的同時分析檢測。DNA四面體納米結構探針是由四條單鏈寡核苷酸(ssDNA)通過簡單的一步退火制得,其中兩條ssDNA包含兩個熒光淬滅的發(fā)卡型結構。當有目標miRNA存在時,兩個發(fā)卡型結構被所對應的miRNA特異性雜交打開并恢復不同的熒光信號從而實現(xiàn)對miRNA的多重檢測。更為重要的是,和普通的DNA分子信標相比較,DNA四面體納米結構探針在細胞裂解物中具有良好的穩(wěn)定性,可高效穩(wěn)定地進入細胞并實現(xiàn)細胞內兩種不同miRNA的同時檢測。自組裝DNA四面體納米結構對細胞內miRNA的成功傳感分析為其在成像、藥物遞送和體內癌癥治療中地深入應用提供了有利的技術支持和潛能。5.可編程DNA環(huán)/發(fā)卡納米結構應用于單細胞中多重mRNA的高靈敏成像近年來大量研究證明mRNA地表達與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉移具有十分密切的關系,且mRNA被作為一種新型的腫瘤標志物應用于癌癥的早期診斷和機理探討。因此,單個癌細胞內多種mRNA的同時原位檢測和成像對于癌癥早期檢測具有重要意義。本研究構建了一個可編程DNA環(huán)/發(fā)卡納米結構,以細胞內特異性表達的兩種重要mRNA為引發(fā)劑啟動滾環(huán)擴增反應,并通過不同熒光信號分子的識別雜交實現(xiàn)單個癌細胞中TK1和Survivin mRNA的同時原位熒光檢測,且檢測分辨率接近單分子水平。與傳統(tǒng)的RCA成像方法相比較,本研究提出的原位RCA檢測方法操作步驟簡單,成功避免了復雜的目標mRNA反轉錄過程以及掛鎖DNA探針的連接過程。同時,通過使用熒光淬滅的dsDNA信號探針顯著降低背景噪聲并使用發(fā)卡識別探針增強了檢測的選擇性。該研究方法利用原位滾環(huán)擴增信號放大和多重熒光檢測性能的優(yōu)勢,實現(xiàn)了癌細胞內兩種低表達mRNA的原位放大檢測并有效抑制了假陽性信號的產(chǎn)生,為早期癌癥診斷提供了更加準確和完整的參考信息。
【圖文】：

圖 1.1 生物傳感器原理圖Fig.1.1 Schematic diagram of biosensor1.3 信號放大技術在實際的生物檢測分析中，尤其是在疾病臨床早期診斷、食品藥品監(jiān)測、環(huán)

圖 1.2 核酸外切酶Ⅲ輔助的目標物循環(huán)放大策略原理圖[7]。g. 1.2 Schematic illustration of exonuclease III aided target recycling strategy. Copyri2010ACS.
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3

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本文編號：2594931