四環(huán)素類抗生素(TCs)作為一種廣譜抗菌藥,被廣泛應(yīng)用于獸藥和飼料添加劑中。隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化和集約化發(fā)展,獸用抗生素濫用現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素約80~90%以原藥或其代謝產(chǎn)物的形式排出體外,然而,我國尚無較完善的針對抗生素的處理技術(shù)體系及相關(guān)排放要求,殘留在各種養(yǎng)殖廢水中的抗生素最終進(jìn)入水環(huán)境中?目前,關(guān)于TCs對水生生物氧化損傷的研究已有很多,但對其影響水生生物抗氧化能力的潛在分子機(jī)制知之甚少。本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)對贛江流域周邊3個(gè)規(guī)�；i養(yǎng)殖場廢水處理工藝中部分構(gòu)筑物出水及排放口下游水體中代表性TCs(包括金霉素、土霉素和四環(huán)素)的殘留特征進(jìn)行分析。進(jìn)一步地,以斑馬魚為水生模式生物,研究它們在斑馬魚幼魚體內(nèi)的富集與代謝特征。最后,考察這三種抗生素對斑馬魚幼魚抗氧化系統(tǒng)的影響并采用分子計(jì)算毒理學(xué)技術(shù)研究TCs和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)間的相互作用,以初步探索TCs造成魚體氧化損傷的作用機(jī)理。主要研究成果如下:(1)在3個(gè)規(guī)�；B(yǎng)豬場的水樣中均檢出了金霉素、土霉素和四環(huán)素。各豬場所配備的常規(guī)厭氧-好氧組合工藝對畜禽養(yǎng)殖廢水中TCs的處理效率均高于89%,但工藝出水中TCs的殘留濃度仍處于μg/L水平,且在排放口附近水體中的濃度較為穩(wěn)定。證實(shí)畜禽養(yǎng)殖場附近存在較大抗生素污染負(fù)荷。(2)經(jīng)2 mg/L金霉素、5 mg/L土霉素和2 mg/L四環(huán)素暴露48 h后,斑馬魚幼魚體內(nèi)的抗生素含量分別為0.53 mg/kg、0.29 mg/kg和0.19 mg/kg(濕重),相應(yīng)的BCF_(48h)值分別為0.3206、0.0621和0.1152,說明這三種抗生素生物富集能力很弱。在清水暴露階段,它們的消除速率常數(shù)分別為0.022 h~(-1)、0.012 h~(-1)、0.014 h~(-1),相應(yīng)的半衰期分別為31.51 h、57.76 h、49.51 h,說明金霉素、土霉素和四環(huán)素在生物體內(nèi)的代謝較快。(3)金霉素、土霉素和四環(huán)素均能導(dǎo)致斑馬魚幼魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激,且大小關(guān)系表現(xiàn)為:金霉素四環(huán)素土霉素。在金霉素暴露條件下,SOD、CuZn-SOD、CAT、GP_X活性均降低,GSH和MDA含量升高,SOD、CAT、Nrf2基因表達(dá)量下降,SOD、CAT、Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào);在土霉素暴露條件下,CAT、GST活性均被抑制,GP_X活性升高,MDA含量顯著降低,SOD、CAT、Nrf2基因表達(dá)量整體下降,SOD、CAT、Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈濃度依賴性下調(diào);在四環(huán)素暴露條件下,SOD、CuZn-SOD、CAT、GP_X、GST活性均被誘導(dǎo),GSH含量升高,SOD、CAT、Nrf2基因表達(dá)量提高。隨著暴露濃度的升高,SOD、CAT蛋白表達(dá)由誘導(dǎo)狀態(tài)轉(zhuǎn)為被抑制狀態(tài),Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平則呈濃度依賴性下調(diào)。分子對接與動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示三種抗生素均能通過氫鍵與zfPI3K緊密結(jié)合,并且zfPI3K蛋白激酶中的GLN636是對結(jié)合自由能起著最主要貢獻(xiàn)的氨基酸殘基。由此推測金霉素、土霉素和四環(huán)素可能是潛在的PI3K抑制劑,能夠抑制Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激調(diào)控,從而降低斑馬魚幼魚的抗氧化能力。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X171.5;X713
【部分圖文】：

的出水口以及排放口下游 100 m 處（在液面下 20 cm 采樣）進(jìn)行布點(diǎn)點(diǎn)位采 3 個(gè)平行樣，樣品用 1000 mL 聚乙烯塑料瓶封口，用錫箔紙包冰袋保存帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃儲(chǔ)存并盡快進(jìn)行預(yù)處理和檢測。.2 斑馬魚幼魚的獲取野生型 AB 系斑馬魚飼養(yǎng)于斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)（Tecniplast，意大利，圖 2.1 所示）中。水質(zhì)條件為：水溫 27±1 ℃、pH 值 7.5±0.3、電導(dǎo)率 5光暗周期比為 14 h /10 h（晝/夜），每天喂食 2 次干飼料（Skretting Nu）。選用健康狀況良好的成年斑馬魚用于產(chǎn)卵，產(chǎn)卵前一天晚上將 3 4 條雄魚放入 1.7 L 交配盒（Tecniplast，意大利）中，雌雄魚用透明隔次日早上（約 08：00）抽開隔板，在燈光刺激下雌雄交配產(chǎn)卵。收集 3的魚卵，用系統(tǒng)水清洗胚胎，在體視顯微鏡下挑選受精正常的胚胎置光照培養(yǎng)箱（RXZ 型，寧波江南儀器廠）中，溫度控制在 27±1 ℃。選正常發(fā)育 72 hpf（hours post-fertilization，hpf）的胚胎（已孵化成幼接下來的暴露實(shí)驗(yàn)

USA）；柱溫：35℃；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；金的流動(dòng)相：A 為 0.2%甲酸水溶液，B 為純乙腈；二者洗脫梯度：0～040% B；0.5～2.0 min，40%～70% B；四環(huán)素的流動(dòng)相：A 為 10 m 為純甲醇；洗脫梯度：0~3.0 min，55% B~55% B。譜條件：電噴霧源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM），正離子模度：300 ℃；干燥氣流量：3.0 L/min；霧化氣壓力：15.0 psi；毛2 V；碰撞氣體為氬氣，碰撞室氣壓為 1.30×10-5Pa。其他參數(shù)見表表 2.3 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2.3 Mass spectrum parameters合物 母離子（m/z） 子離子（m/z） 裂解電壓/V 碰撞能霉素 478.9 461.9 100 1霉素 461 425.9 100 2環(huán)素 445 409.9 125 1

第 5 章 TCs 對斑馬魚幼魚抗氧化系統(tǒng)的影響CAT 蛋白的表達(dá)量雖然不多，但其活性均完全表達(dá)出來，因此出表達(dá)變化趨勢不匹配的現(xiàn)象。i 等[158]證實(shí) PI3K/Akt 通路是 Nrf2 信號的上游激活因子。有研究表 蛋白激酶的磷酸化作用會(huì)促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中 Nrf2 的解離。先前已有文獻(xiàn)/Akt 信號通路控制 Nrf2/ARE 信號通路的激活，且 PI3K 蛋白激酶的制 Nrf2 活化[159]。因此，推測這三種抗生素可能通過與 PI3K 相互3K 蛋白激酶的抑制劑，從而導(dǎo)致 Nrf2 蛋白表達(dá)的下降以及受 Nrf2/調(diào)控的 CAT 和 SOD 蛋白表達(dá)的下降。
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本文編號：2847531