發(fā)布時間：2020-05-12 19:49

【摘要】：目前,大量國內外研究表明人類正頻繁受到內分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)的暴露威脅。因此,雙酚A(Bisphenol A,BPA)等毒性效應明確、嚴重威脅人類健康的EDCs在世界范圍內受到了管控或禁用。隨著BPA的禁用,諸如雙酚AF(Bisphenol AF,BPAF)、雙酚F(Bisphenol F,BPF)和雙酚S(Bisphenol S,BPS)等雙酚類似物大量涌入市場。然而,越來越多的研究表明,這些與BPA結構相似的替代物也同樣具有內分泌干擾效應。因此,為了更加高效地進行EDCs的篩選,以尋找更安全可靠的替代物,必須開發(fā)和建立更全面、更深入的毒性評價方法。本論文以BPA及其典型替代物BPAF、BPF和BPS為研究對象,一方面,以H295R細胞為體外模型,采用UPLC-MS/MS技術評價了雙酚A及其典型替代物對激素合成與分泌水平的干擾效應,建立了同時測定多種激素的檢測方法,為尋找更安全的雙酚A替代物提供了技術支持;另一方面,以代謝敏感的HepG2細胞為體外模型,結合~1H-NMR和PCR Array兩種高通量技術探究了雙酚A及其替代物的代謝擾動效應和可能的代謝調控機制,彌補了BPA及其替代物在代謝組學研究上的空白,利用細胞實驗與非靶標的代謝組學技術進行毒性靶點的初篩也為化合物及其替代物的毒性評價提供了一種全新的研究思路和方法。主要研究內容及結果包括以下兩個部分:(1)采用UPLC-MS/MS技術建立了同時測定9種類固醇激素的方法,并以H295R細胞為模型,研究BPA、BPAF、BPF和BPS暴露對胞外激素分泌水平的影響,以評價BPA及其替代物的內分泌干擾效應。結果表明:所建立的UPLC-MS/MS同時測定9種類固醇激素方法的專屬性、精確度和準確度良好,各目標激素在線性范圍內均線性良好(r~20.99),且檢測限和定量限均?1 ng/mL(孕酮、雄烯二酮和睪酮的定量限?0.05 ng/mL),基質效應在83.87~119.46%之間,回收率均在80.03~113.32%范圍內。此外,對H295R細胞胞外類固醇激素水平的測定結果顯示,BPA與BPF對孕酮、17α-羥基孕酮、雄烯二酮、睪酮和17β-雌二醇的干擾能力均相近,且對孕酮、17α-羥基孕酮和17β-雌二醇的干擾能力強于BPAF和BPS。此外,4種BPs在10~-66 M濃度下均能顯著下調雄烯二酮和睪酮水平并顯著上調17β-雌二醇水平,即均有雌激素激動作用和雄激素抑制作用。通過比較各激素水平發(fā)生顯著變化的濃度,發(fā)現BPA及其三種典型替代物的激素干擾能力由強到弱為:BPA、BPFBPSBPAF。(2)采用~1H-NMR和PCR Array技術研究BPA、BPAF、BPF和BPS暴露對HepG2細胞胞外代謝產物和胞內相關代謝基因表達水平的影響,從基因和代謝層面系統(tǒng)探究BPA及其替代物對人體健康的可能風險和毒作用分子機制。結果表明:BPA及其替代物能對7~15種代謝產物產生干擾,包括丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等氨基酸,乙酸、乳酸、丙酮酸等糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間體或終產物。此外,這些差異性代謝產物與3~8條代謝通路的擾動相關,其中包括丙酮酸代謝和丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝等常見的代謝通路。通過比較差異性代謝產物和受擾動代謝通路的數量,發(fā)現BPA及其三種典型替代物的代謝擾動能力由強到弱為:BPFBPABPAFBPS。通過糖代謝PCR Array分析發(fā)現,BPAF能通過上調丙酮酸激酶相關基因(PKLR)的表達水平以干擾糖代謝過程,而BPA、BPF和BPS能通過下調葡萄糖激酶相關基因(GCK)的表達水平以抑制葡萄糖感應功能發(fā)揮作用。綜上,結合代謝組學和PCR Array技術探究潛在的代謝調控機制,并為未來的靶向風險評估確定潛在目標是有潛力的。
【圖文】：

浙江工業(yè)大學碩士學位論文結果 A 及其替代物對 H295R 細胞活性的影響采用 MTS 法研究了 BPA、BPAF、BPF 和 BPS 對 H295R 細胞活固醇激素分泌水平測定實驗中的藥物濃度選擇（圖 3-1）。與溶10-5M 濃度下，，BPA 及其 3 種典型替代物 BPAF、BPF 和 BPS 均出顯著的細胞毒性（p＜0.05）；在10-9M~10-6M濃度下，各處理組顯著的細胞毒性（p＞0.05）。為排除細胞死亡對實驗的影響，細胞毒性濃度（10-9、10-8、10-7和 10-6M）進行后續(xù)實驗。

27圖 3-2 質控樣品中各目標化合物的 MRM 色譜圖Figure 3-2. MRM chromatogram of target compounds in QC samples.
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X703

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