【摘要】：海洋石油污染日益嚴(yán)峻,海洋石油降解菌代謝機(jī)制研究一直是環(huán)境微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)B5是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的石油降解菌新種,廣泛分布在各種海洋環(huán)境中,對(duì)各類烷烴有較強(qiáng)的降解能力。基于基因組、轉(zhuǎn)錄組以及功能基因的研究,我們實(shí)驗(yàn)室從中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)烷烴感應(yīng)、趨化、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控的關(guān)鍵因子,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn),在信號(hào)傳導(dǎo)與代謝調(diào)控系統(tǒng)中,Cyo末端氧化酶位于趨化系統(tǒng)與代謝系統(tǒng)之間,調(diào)控著不同鏈長(zhǎng)烷烴的代謝途徑,cyo D缺失會(huì)抑制長(zhǎng)鏈烷烴的降解能力,而能促進(jìn)短鏈烷烴的利用。同時(shí)Cyo末端氧化酶還能夠負(fù)調(diào)控烷烴代謝相關(guān)基因alm R的表達(dá)。但Cyo末端氧化酶調(diào)控烷烴降解途徑的機(jī)制仍不清楚。針對(duì)這一問題本研究對(duì)B5基因組進(jìn)行深入分析,在cyo基因下游發(fā)現(xiàn)了B5T_00995和B5T_00996兩個(gè)相關(guān)基因。通過同源分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后,發(fā)現(xiàn)B5T_00995基因編碼一個(gè)N-端具有六次跨膜結(jié)構(gòu)、C-端具有組氨酸激酶活性的激酶組分;而B5T_00996基因編碼產(chǎn)物被證明對(duì)烷烴降解相關(guān)基因alm R具有阻遏作用,兩者構(gòu)成雙組份系統(tǒng)。同源分析結(jié)果表明,B5T_00995基因編碼的激酶組分在第三、四次跨膜結(jié)構(gòu)之間存在一個(gè)保守的GGXXNPF七肽序列,該序列被認(rèn)為是一個(gè)醌結(jié)合位點(diǎn)。將B5T_00995和B5T_00996基因編碼蛋白體外純化后進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B5T_00995基因編碼的蛋白在ATP存在的情況下可以發(fā)生自我磷酸化過程,該磷酸化過程可以被氧化型醌抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn),自我磷酸化的B5T_00995編碼蛋白可以磷酸化B5T_00996基因編碼蛋白,即B5T_00995和B5T_00996基因編碼產(chǎn)物可以構(gòu)成雙組份系統(tǒng),且醌能夠影響激酶組分的自我磷酸化過程。研究結(jié)果表明,在B5菌株的好氧呼吸鏈中,上游電子供體將電子傳遞給氧化型醌(CoQ),使其發(fā)生還原反應(yīng)變成還原型醌(QH_2)。還原型醌被Cyo末端氧化酶氧化變成氧化型醌,電子被末端氧化酶?jìng)鬟f給O_2,變成H_2O,從而完成電子傳遞。B5T_00995和B5T_00996基因編碼的雙組份系統(tǒng)中的感應(yīng)組分能夠感應(yīng)還原型醌,從而組氨酸激酶活性被激活,激酶組分發(fā)生自我磷酸化后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至B5T_00996基因編碼的調(diào)控組分,使其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。隨后調(diào)控組分作為調(diào)控蛋白調(diào)控烷烴代謝相關(guān)基因表達(dá)。
【圖文】：

石油處理并添加一些無機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素后則增加 70％[36]。2.3 本實(shí)驗(yàn)關(guān)于柴油食烷菌 Alcanivorax dieselolei B5 的研究柴油食烷菌（Alcanivoraxdieselolei）B5 是我們實(shí)驗(yàn)室 2005 年從勝利油田黃河入�？诓澈：Ｓ蛴臀廴镜谋韺雍Ｋ蛛x得到，后來在沿海至遠(yuǎn)洋海域也有發(fā)現(xiàn)該菌種，它在表層海水至深層海水中都有分布[26, 37-40]。A. dieselolei B5 為革蘭氏陰性，γ-變形菌綱，桿狀，無芽孢，叢生鞭毛，能夠在 15-45℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適溫度為 28℃，鹽度生長(zhǎng)范圍為 1-15％，最適鹽度為 3-7.5％。A.dieseloleiB5能夠降解多種烷烴（C6-C36），包括支鏈烷烴[41, 42]。并且它能夠產(chǎn)生一種脂肽作為生物活性劑加速烷烴的吸收[43]，同時(shí) B5 可以編碼一系列烷烴單加氧酶，包括AlkB、CYP、AlmA，其中 AlmA 被認(rèn)為與長(zhǎng)鏈烷烴降解有關(guān)[41]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)A.dieseloleiB5不同鏈長(zhǎng)的烷烴代謝網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究，并發(fā)現(xiàn)了一些列烷烴感知、趨化、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控的關(guān)鍵因子并闡述了其作用機(jī)制[44]。

3.2 細(xì)菌有氧呼吸呼吸鏈及末端氧化酶在原核生物中，呼吸鏈?zhǔn)侵肝挥诩?xì)胞膜上，一組呈氧化還原電勢(shì)梯度差、鏈狀排列的電子傳遞體，它們可以逐級(jí)地把電子從低氧化還原電勢(shì)的化合物傳遞到高氧化還原電勢(shì)上并使其還原。在此過程中，，偶聯(lián)氧化磷酸化反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)跨膜的質(zhì)子動(dòng)勢(shì)，從而進(jìn)一步合成 ATP。組成呼吸鏈的這一系列傳遞電子載體，除呼吸醌之外，都是蛋白質(zhì)或者含有輔基、輔酶的酶。原核生物中，以及原核生物與真核生物的呼吸鏈組分都是相似的（見圖 2），生物體內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生的化學(xué)能以 NADH2、FADH2為載體經(jīng) NADH2脫氫酶或琥珀酸脫氫酶將電子傳遞給醌，氧化型醌接受電子變成攜帶電子的還原型。還原型醌上的電子一部分經(jīng)細(xì)胞色素 c 還原酶?jìng)鬟f給細(xì)胞色素 c，被細(xì)胞色素 c 氧化酶氧化后，將電子傳遞給氧氣生成水，另一部分由泛醌氧化酶直接將電子從還原型醌傳遞給氧氣。
【學(xué)位授予單位】：國(guó)家海洋局第三海洋研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X55;X172

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本文編號(hào)：2604601