【摘要】：背景:世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告,抑郁癥占據(jù)世界疾病負(fù)擔(dān)總數(shù)的4.8%,至2030年將躍居為世界第一大負(fù)擔(dān)疾病。因此,深入揭示抑郁癥發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)理以及發(fā)現(xiàn)抑郁癥治療的有效方法具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和醫(yī)學(xué)意義。晝夜節(jié)律改變導(dǎo)致的睡眠障礙和褪黑素分泌紊亂是抑郁癥的主要特征。褪黑素(melatonin,MT)主要由哺乳動(dòng)物松果體分泌,具有明顯的晝夜節(jié)律。5-羥色胺(serotonin,5-HT)、5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(serotonin N-acetyltransferase,SNAT)和N-乙�；�-5-羥色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylserotonin methyltransferase,ASMT)是MT水平的重要調(diào)節(jié)因子。研究表明,ASMT基因多態(tài)性與抑郁癥高度相關(guān),運(yùn)動(dòng)則能通過調(diào)節(jié)MT及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等機(jī)制緩解抑郁癥狀。因此,ASMT在抑郁發(fā)病機(jī)制以及運(yùn)動(dòng)干預(yù)中的作用值得進(jìn)一步研究。目的:探究ASMT基因敲除是否導(dǎo)致小鼠的抑郁行為,并揭示運(yùn)動(dòng)對(duì)大腦神經(jīng)可塑性的作用和機(jī)制,以期為運(yùn)動(dòng)干預(yù)抑郁癥的機(jī)制研究以及抑郁癥的臨床研究提供新的靶點(diǎn)。方法:本實(shí)驗(yàn)選用雌性純合子ASMT基因敲除小鼠15只,同窩野生型小鼠14只(背景均為C57BL/6小鼠),6-7周齡,體重24-25g。根據(jù)小鼠基因型分成四組,每組7-8只:(1)WT組(n=7),即野生控制組,正常飼養(yǎng),不施加任何干預(yù);(2)WE組(n=7),即野生運(yùn)動(dòng)組,實(shí)驗(yàn)小鼠6-7周齡時(shí)開始接受5周的游泳訓(xùn)練;(3)KO組(n=8),即基因敲除組,鑒定為ASMT基因敲除小鼠后,正常飼養(yǎng),不施加任何干預(yù);(4)KE組(n=7),即敲除運(yùn)動(dòng)組,ASMT基因敲除小鼠6-7周齡時(shí)開始接受5周的游泳訓(xùn)練。5周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,各組小鼠接受抑郁行為學(xué)檢測(cè),行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,將小鼠麻醉取血和海馬組織。檢測(cè)血清5-HT、MT、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)的含量;采用電鏡檢測(cè)海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)與數(shù)量;采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)海馬CA1區(qū)和齒狀回區(qū)的神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、突觸蛋白(synapsin,SYP)、生長相關(guān)蛋白-43(growth-associated protein-43,GAP-43)等神經(jīng)可塑性標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1抑郁行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組在糖水實(shí)驗(yàn)(SPT)中的糖水消耗量顯著降低(P0.05),在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)中的不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P0.05),掙扎時(shí)間非常顯著減少(P0.01)在開場實(shí)驗(yàn)(OFT)中的中央路程顯著減少(P0.05);與KO組相比,KE組在SPT中的糖水消耗量顯著升高(P0.05)。2血清酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組的MT血清含量下降但未達(dá)到顯著性差異,去甲腎上腺素(NE)的血清含量顯著上升(P0.05);與KO組相比,KE組的MT含量上升,但未達(dá)到顯著性差異,5-HT含量顯著增加(P0.05)。3電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組海馬CA1區(qū)PSD厚度顯著下降(P0.05),而突觸間隙的寬度非常顯著升高(P0.01),突觸數(shù)量顯著下降(P0.05)。與KO組相比,KE組海馬CA1區(qū)PSD厚度非常顯著升高(P0.01),突觸間隙寬度下降,但未達(dá)到顯著性差異。4免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組在海馬CA1v區(qū)NeuN表達(dá)顯著下降(P0.05),在CA1d區(qū)GFAP表達(dá)顯著升高(P0.05),在DG區(qū)GAP-43表達(dá)非常顯著降低(P0.01),NeuN表達(dá)顯著升高(P0.05),GFAP表達(dá)顯著升高,WE組在海馬CA1d區(qū)GFAP表達(dá)顯著下降(P0.05)。與KO組相比,KE組在海馬CA1v區(qū)GAP-43表達(dá)顯著升高(P0.05),GFAP表達(dá)顯著升高(P0.05),在CA1d區(qū)NeuN表達(dá)顯著升高(P0.05),GFAP表達(dá)非常顯著下降(P0.01),在GD區(qū)GAP-43表達(dá)顯著升高(P0.05),NeuN表達(dá)顯著下降(P0.05),GFAP表達(dá)顯著下降(P0.05)。結(jié)論:(1)ASMT基因敲除可誘發(fā)小鼠抑郁行為,游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)此有明顯改善作用,且這種改善作用可能與血清MT和5-HT的水平有關(guān)。(2)ASMT基因敲除會(huì)使小鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)造成破壞,突觸數(shù)量減少,游泳運(yùn)動(dòng)能一定程度上逆轉(zhuǎn)突觸結(jié)構(gòu)上的改變。(3)ASMT基因敲除可總體下調(diào)GAP-43、NeuN、SYP,上調(diào)GFAP在海馬CA1v、CA1d區(qū)與DG區(qū)的表達(dá),游泳運(yùn)動(dòng)可一定程度上逆轉(zhuǎn)這些變化,卻進(jìn)一步上調(diào)了CA1v區(qū)GFAP的表達(dá)。意義:本研究采用ASMT基因敲除小鼠作為動(dòng)物模型,探討了ASMT基因敲除導(dǎo)致的褪黑素分泌障礙是否會(huì)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抑郁行為,是對(duì)抑郁動(dòng)物模型的新探索;其次以大腦神經(jīng)可塑性作為切入點(diǎn)對(duì)ASMT基因敲除小鼠進(jìn)行研究,探究運(yùn)動(dòng)干預(yù)作用對(duì)小鼠抑郁行為的影響極其機(jī)制,為運(yùn)動(dòng)抗抑郁作用提供更堅(jiān)實(shí)的佐證。
【圖文】：

華東師范大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文9圖1-1. 晝夜節(jié)律變化對(duì)血清褪黑素濃度以及大腦神經(jīng)可塑性的影響Figure 1-1. Influence of circadian rhythm changes on serum melatonin concentration and brainneuroplasticity[106].2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組由仁源生物技術(shù)（上海）有限公司采用 CRISPR 技術(shù)構(gòu)建 ASMT 全身性因敲除小鼠，與野生型小鼠（背景均為 C57BL/6）并進(jìn)行繁殖。待小鼠 3-4 周齡，體重 17-20g 時(shí)對(duì)同窩小鼠按性別分籠，打耳釘進(jìn)行標(biāo)記并將小鼠尾巴末端剪去 2mm 左右樣本進(jìn)行基因鑒定。此時(shí)進(jìn)行標(biāo)記、取材與分籠是因?yàn)樾∈筮_(dá)到斷奶周齡，可以進(jìn)食飼料，同時(shí)防止小鼠進(jìn)一步成熟后發(fā)生交配行為；分籠與取材一次性完成也可減少對(duì)小鼠傷害的次數(shù)。通過基因鑒定最終選取 F3 代雌性性純合子 ASMT 基因敲除小鼠 15 只，F(xiàn)3 代同窩野生型小鼠 14 只。隨后所有小鼠還需進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng) 3 周，至小鼠體重達(dá)到 24-25g。

實(shí)驗(yàn)處理流程圖
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：G804.2

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本文編號(hào)：2620769