背景據(jù)報(bào)道全世界有超過(guò)85%的成年人經(jīng)受過(guò)頸腰痛的痛苦。因頸腰疼痛到醫(yī)院就診的病人數(shù)位居第2位,僅次于上呼吸道感染,尤其對(duì)于兒童和青年人頸椎椎間盤(pán)源性疼痛而言,雖然發(fā)病率罕見(jiàn),但由于生活方式的改變,社會(huì)心理因素(如環(huán)境或情感等)均與之有較大的關(guān)系。此疾病不單給患者造成了很大的疾苦,也造成巨額的醫(yī)療成本損失。研究認(rèn)為引起頸腰疼痛的主要病因是由于椎間盤(pán)退變所引起,生活節(jié)奏快和工作壓力大的現(xiàn)代生活方式使得椎間盤(pán)退變的發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化,因此對(duì)該疾病的研究引起國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)生和科研工作者的廣泛重視。在椎間盤(pán)退變?cè)缰衅陔A段一般采用緩解疼痛的姑息性理化療法；晚期階段則以有創(chuàng)性手術(shù)治療為主。但目前的醫(yī)療技術(shù)尚未找到一種治愈椎間盤(pán)退變的方法。自1987年Friedenstein等發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞以來(lái),其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到飛速發(fā)展。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛,具有很強(qiáng)的增殖和多向分化潛能,目前已廣泛應(yīng)用于多種疾病的免疫和再生治療的應(yīng)用研究。相應(yīng)地,干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展也為椎間盤(pán)治療帶來(lái)了新的希望。研究者將具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)注射器注入到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物退變的髓核內(nèi),可再生修復(fù)髓核組織。但是由于髓核組織內(nèi)壓力過(guò)大,注射的干細(xì)胞懸液容易通過(guò)注射針孔發(fā)生返流而產(chǎn)生其他副作用,諸如形成骨贅等引起額外的疼痛。再者,退變的髓核組織內(nèi)環(huán)境相當(dāng)惡劣,注入的干細(xì)胞可能大部分無(wú)法耐受而走向凋亡或死亡。生物醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展為干細(xì)胞再生治療椎間盤(pán)退變提出了新的策略,組織相容性生物材料可以包裹干細(xì)胞以提供保護(hù)和微環(huán)境支持,且水凝膠等材料可以為細(xì)胞提供類似在體的三維環(huán)境。一些溫敏性水凝膠的體內(nèi)原位成膠性能,使其成為良好的可注射的組織工程材料,因此可用于微創(chuàng)修復(fù)椎間盤(pán)退變。然而已有報(bào)道表明,水凝膠的機(jī)械性能較差,不能為高負(fù)載的椎間盤(pán)提供足夠的力學(xué)支持。再者,溫敏性水凝膠在未成膠前的細(xì)胞混懸液仍然可能被較高的髓核內(nèi)壓擠出針孔外。椎間盤(pán)退變與下腰痛有關(guān)已被廣泛證實(shí),人體椎間盤(pán)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)具有高特異性的特點(diǎn),其對(duì)物理化學(xué)微環(huán)境要求較高,椎間盤(pán)內(nèi)細(xì)胞數(shù)量少,并且生化代謝緩慢,此微小環(huán)境還不能夠被目前的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)或動(dòng)物模型所模擬反映。器官培養(yǎng)模型技術(shù)的發(fā)展具有很好的潛力,通過(guò)組織內(nèi)三微環(huán)境相互作用,精確力學(xué)載荷和化學(xué)干預(yù)可反映人體間盤(pán)內(nèi)的微環(huán)境。椎間盤(pán)器官培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展較快,從先前比較單一的溶劑培養(yǎng)到后來(lái)的計(jì)算機(jī)精確控制干預(yù),到采用多腔室、多軸系統(tǒng)維持間盤(pán)結(jié)構(gòu)完整性、控制組織營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),模擬椎間盤(pán)生理?xiàng)l件或?qū)嵤┝W(xué)加載破壞間盤(pán)組織等。通過(guò)一系列施加條件阻止細(xì)胞外基質(zhì)膨脹及增加營(yíng)養(yǎng)傳輸,成熟的器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚪鉀Q一些關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。由于犬椎間盤(pán)具有高度重復(fù)性、一致性、相似的成分比例和代謝速率特點(diǎn),這種動(dòng)物椎間盤(pán)模型能夠?yàn)橹委熕幬锖Y選的研發(fā),尋求退變病理過(guò)程中的力學(xué)機(jī)制轉(zhuǎn)變和生理生化反應(yīng)機(jī)理研究。因此,這種模型可初步用于探索抑制椎間盤(pán)內(nèi)分解代謝和促進(jìn)合成代謝的治療機(jī)制。清華大學(xué)合作課題組前期研究工作發(fā)明了一種新型可注射微冰膠,這種微型冰膠以生物相容性材料聚乙二醇丙烯酸(Poly (ethylene glycol), PEG)為原材料,加入一定濃度化學(xué)交聯(lián)劑低溫緩慢成膠,冷凍干燥冰晶而獲得多孔隙結(jié)構(gòu)。PEG微冰膠大小和形狀可控,伸縮性能良好,體內(nèi)可降解。此種微冰膠與水凝膠干細(xì)胞細(xì)胞混懸液結(jié)合,為干細(xì)胞提供了不被體內(nèi)退變微環(huán)境損傷的三維支持；同時(shí),可以實(shí)現(xiàn)非溫敏性水凝膠的注射治療方式；還可以增強(qiáng)水凝膠的機(jī)械性能,形象地講,微冰膠為水凝膠提供了骨架支持。同時(shí),微冰膠良好的彈性使其可以通過(guò)臨床微量注射器針頭(27G)實(shí)現(xiàn)注射治療,且形態(tài)立即恢復(fù),不會(huì)被擠出針孔外,并且細(xì)胞極少發(fā)生死亡。經(jīng)過(guò)定向誘導(dǎo)能夠高效促進(jìn)(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)向髓核樣細(xì)胞分化。從這些特征看來(lái),微冰膠是潛在的治療椎間盤(pán)退變的細(xì)胞載體系統(tǒng)。因此我們認(rèn)為本研究的意義在于,一種新型可注射和可降解的細(xì)胞載體和傳輸系統(tǒng)有望提高椎間盤(pán)退變的再生治療效果。首先,微冰膠可為MSCs提供保護(hù)及三維支持,輔助干細(xì)胞治療可發(fā)揮再生修復(fù)的作用；再者,可注射微冰膠系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了治療的微創(chuàng)性；其次,微冰膠良好膨脹收縮性能使其注射后不會(huì)從針孔擠出,最大程度的保留了細(xì)胞和減少了因細(xì)胞溢出而產(chǎn)生的副作用；第四,微冰膠良好的機(jī)械性能可為脊柱提供一定程度的力學(xué)支撐；最后,微冰膠生物相容性好,不會(huì)產(chǎn)生毒副作用。椎間盤(pán)退變的早期發(fā)現(xiàn)主要依賴于核磁影像學(xué)(Magnectic Reasonance Imaging, MRI)的檢測(cè),生物學(xué)治療的檢測(cè)結(jié)果一直采用傳統(tǒng)MRI進(jìn)行隨訪觀察。Pfirrmann分級(jí)是評(píng)估椎間盤(pán)退行性病變的經(jīng)典檢測(cè)手段,但由于Pfirrmann分級(jí)是一種半定量檢測(cè)方法,因此需要一種更為早期、敏感的影像學(xué)檢測(cè)技術(shù)來(lái)更為準(zhǔn)確的評(píng)估退變程度或治療效果。傳統(tǒng)的組織學(xué)技術(shù)是檢驗(yàn)椎間盤(pán)退變的金標(biāo)準(zhǔn),但由于有創(chuàng)操作無(wú)法在臨床中實(shí)施。T2弛豫時(shí)間值(T2 relaxation times)是應(yīng)用T2圖(T2 mapping)進(jìn)行量化測(cè)定的指標(biāo),可以通過(guò)描述氫質(zhì)子系統(tǒng)(組織)橫向馳豫衰減來(lái)量化反映組織水分子狀態(tài)的變化,通過(guò)衡量不同回波時(shí)間的MRI信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算得出值。T2弛豫時(shí)間成像是MRI研究組織水分子狀態(tài)的一項(xiàng)新技術(shù),國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道椎間盤(pán)內(nèi)髓核的T2值與膠原的排列方向、膠原、蛋白及水的含量相關(guān),能夠定量地反映髓核內(nèi)生化成分的改變,因此通過(guò)定量T2弛豫時(shí)間成像技術(shù)能夠反映早期椎間盤(pán)內(nèi)生化的改變,為早期椎間盤(pán)的生化改變及鑒定提供一種新的方法。綜上所述,首先,本研究擬將PEG制備的微冰膠材料,通過(guò)體外器官長(zhǎng)期培養(yǎng)觀察其對(duì)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs)的存留情況及對(duì)犬退行性椎間盤(pán)退行性病變的修復(fù)研究,期望這種新型可注射微冰膠材料不僅可以為ADSCs提供三維培養(yǎng)環(huán)境,而且還具有防止注射細(xì)胞滲漏,延長(zhǎng)其作用時(shí)間,提高干細(xì)胞的生物學(xué)活性及修復(fù)椎間盤(pán)退變功能。其次,本研究首先通過(guò)測(cè)量青年人頸椎間盤(pán)MRI T2弛豫時(shí)間值,量化分析頸椎間盤(pán)早期含水量、大分子蛋白多糖和膠原纖維成分等的生化狀態(tài)變化與傳統(tǒng)Pfirrmann半定量分級(jí)之間的關(guān)系,探究T2弛豫時(shí)間成像技術(shù)在早期頸椎間盤(pán)退行性病變中應(yīng)用的可行性,為MRI對(duì)椎間盤(pán)退行性改變的客觀評(píng)價(jià)提供量化標(biāo)準(zhǔn)。目的1、應(yīng)用PEG微冰膠(Microcryogels, MGs)裝載包裹MSCs的海藻酸鈉水凝膠(PEG-Microcryogels, PMs),體外器官培養(yǎng)觀察PMs支架材料對(duì)ADSCs的存留觀察及微環(huán)境對(duì)MSCs的影響；2、體內(nèi)觀察利用PMs支架材料裝載ADSCs長(zhǎng)期修復(fù)退變椎間盤(pán)的可行性。3、通過(guò)測(cè)量青年志愿者頸椎間盤(pán)髓核MRI T2弛豫時(shí)間值,探討T2弛豫時(shí)間成像技術(shù)在早期頸椎間盤(pán)退變中應(yīng)用的可行性。方法1、PMs微冰膠制備：用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)制圖軟件制作微孔陣列圖形,以聚甲基丙烯酸酯(Polymethyl methacrylate, PMMA)薄板為原料,在激光雕刻機(jī)上制作微孔模具板,長(zhǎng)75cm,寬25cm,厚300μm,約600個(gè)孔每板；為增加模具板親水性,等離子處理2min;10%質(zhì)量/體積(Weighte/volum, w/v) PEGDA與0.2%w/v四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine, TEMED)和0.5% w/v過(guò)硫酸銨(Ammonium Persulfate, APS)配成微冰膠預(yù)備液；用刮片的方法使微冰膠預(yù)備液進(jìn)入每一個(gè)微孔,置于零下20度成膠；真空冷凍干燥形成多空聯(lián)通結(jié)構(gòu)(-45℃,30min)；微冰膠浸泡于雙蒸水中可以即可從模具板上脫出,收集到70μm漏網(wǎng),用蒸餾水清洗后濾除多余水分；將微冰膠置于小皿中鋪成薄層,二次冷凍備用。使用之前,冷凍干燥后紫外線(Ultraviolet, UV)滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌后即可裝載細(xì)胞。2、選用4個(gè)含有兩段完整的椎骨及椎間盤(pán)的運(yùn)動(dòng)節(jié)段(T12-L1, L2-L3, L4-L5, L6-L7)的椎間盤(pán)組織,利用10ml注射器和21G針頭從纖維環(huán)(Annulus Fibrosus, AF)扎入,抽取髓核(Nucleus Pulposus, NP)組織(約25mmg)。吸取40μl1×105 Luc-GFP的MSCs懸液,另一組為40μl負(fù)載相同數(shù)量MSCs的PMs重懸于0.5%透明質(zhì)酸溶液,均由21G針頭注射入髓核進(jìn)行對(duì)比,于器官營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)一月后,每5天觀察生物熒光圖像,評(píng)估細(xì)胞在NP中的停留,第30天福爾馬林液固定椎間盤(pán)并用于組織學(xué)染色分析。3、選用15只比格犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,用髓核抽吸法建立犬椎間盤(pán)退變模型(L3-4/L4-5/L5-6/L6-7),動(dòng)物實(shí)施造模術(shù)后4周行腰椎正側(cè)位X線和MRI檢查建立犬椎間盤(pán)退行性病變椎間盤(pán)模型,證實(shí)退變模型造模成功后,對(duì)剩余12只動(dòng)物模型行ADSCs移植手術(shù)。每只犬的椎間盤(pán)被分為4組：退變組(Sham,L3-4),單純干細(xì)胞注射組(MSCs, L4-5),單純材料注射組(PMs,L5-6),材料裝載干細(xì)胞移植組(PMs+MSCs,L6-7),其中L7-S1作為陰性對(duì)照組,不做任何處理。細(xì)胞移植術(shù)后4、8、12和24周進(jìn)行動(dòng)物腰椎正側(cè)位X線片及MRI檢查,量化椎間盤(pán)相對(duì)高度指數(shù)及髓核相對(duì)灰度指數(shù)；組織學(xué)評(píng)分觀察內(nèi)層纖維環(huán)破壞程度,術(shù)后12、24周處死動(dòng)物取材,對(duì)髓核組織進(jìn)行冰凍切片,利用熒光顯微鏡觀察冰凍切片綠色熒光蛋白表達(dá)情況；整體椎間盤(pán)及髓核組織普通切片,利用HE染色和番紅O染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化,利用免疫組織化學(xué)染色觀察各組椎間盤(pán)周圍組織的Ⅱ型膠原、蛋白聚糖(ACAN)及移植組GFP的表達(dá)；并用EL1SA法檢測(cè)細(xì)胞蛋白多糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原蛋白水平(PG,COL1和COL2)。4、對(duì)40例無(wú)任何癥狀的青年健康志愿者進(jìn)行頸椎3.0 T MRI T2加權(quán)成像(T2 weighted image, T2 WI)和T2弛豫時(shí)間成像技術(shù)掃描。男19例,女21例,年齡18-25歲,平均年齡22.80±2.11歲,所有受試志愿者均無(wú)頸痛和頸椎部畸形/外傷/手術(shù)病史,C3-C7的T2WI和T2弛豫時(shí)間成像技術(shù)掃描均在GE Signa 3.0 T-HD-MRI掃描儀上實(shí)施,GE-ADW 4.3后處理工作站Functool軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,生成T2偽彩圖。在C3-C7髓核及前后纖維環(huán)內(nèi)分別放置感興趣區(qū)域(Region of Interest, ROIs),測(cè)量T2弛豫時(shí)間值。分別對(duì)每個(gè)頸椎間盤(pán)進(jìn)行Pfirrmann (Ⅰ-Ⅴ)分級(jí),分別評(píng)估性別之間、不同解剖部位之間的T2弛豫值,研究T2弛豫值與Pfirrmann退變級(jí)別之間的相關(guān)性。5、采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(SPSS Inc., Chicago, IL, USA),用雙因素方差分析研究分組與時(shí)間的主效應(yīng)和交互效應(yīng),兩個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析或Post Hoc進(jìn)行多重平均值比較,Kappa檢驗(yàn)評(píng)價(jià)觀察者IVDD分級(jí)的一致性。采用Pearson相關(guān)分析分別評(píng)價(jià)椎間盤(pán)NP和AF前后緣T2值與年齡、分級(jí)與年齡的相關(guān)性。三因素方差分析研究性別、解剖部位及解剖節(jié)段之間的交互效應(yīng),誤差限圖及受試者操作特點(diǎn)用于數(shù)據(jù)分析,P值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。結(jié)果1、椎間盤(pán)注射GFP染色細(xì)胞后立即通過(guò)生物發(fā)光活體成像儀觀察,可以發(fā)現(xiàn)單純細(xì)胞注射組明顯的細(xì)胞滲漏,而PMs+MSCs注射組無(wú)滲漏現(xiàn)象,PMs+MSCs注射組能夠顯著存留細(xì)胞,細(xì)胞信號(hào)持續(xù)表達(dá)長(zhǎng)達(dá)25天,而單純MSCs注射組在15天后即無(wú)法觀察到光子信號(hào)。大體觀察和HE染色可觀察到PMs+MSCs注射組能夠顯著維持椎間盤(pán)高度,而MSCs注射組明顯觀察到椎間盤(pán)高度減低。PMs+MSCs注射組中可以顯著保留髓核組織。番紅O染色顯示了椎間盤(pán)中的糖胺聚糖和少量的髓核細(xì)胞,PMs支架結(jié)構(gòu)仍然可以觀察到。免疫組化染色顯示PMs+MSCs注射組較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)ACAN和COL2。2、術(shù)后4周X線結(jié)果顯示造模節(jié)段椎間盤(pán)相對(duì)高度指數(shù)與對(duì)照組對(duì)有無(wú)差異(P0.05),而MRI檢查結(jié)果顯示髓核相對(duì)灰度指數(shù)下降,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),與正常組比較,其他組椎間盤(pán)高度在觀察時(shí)間內(nèi)持續(xù)降低。然而與造模組比較,MSCs注射組和PMs注射組在8、12、24周能夠顯著提高DHI%(P0.05)。PMs+MSCs注射組的椎間盤(pán)降低程度與其他組相比有明顯延緩(P0.05)。NC組的T2信號(hào)強(qiáng)度(Signal Intensity, SI)在觀察時(shí)間內(nèi)基本無(wú)任何變化,與NC對(duì)比后發(fā)現(xiàn),其他所有組的平均SI在4周時(shí)明顯減少(P0.05),而在8周時(shí),PMs+MSCs注射組SI較其他治療組高(P0.05),MSCs注射組和PMs+MSCs注射組之間SI無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但與造模組對(duì)比具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。24w時(shí)收集6只犬標(biāo)本行HE染色,結(jié)果顯示造模組組織學(xué)評(píng)分為4-5,PMs+MSCs注射組評(píng)分為1-2分,而PMs注射組和MSCs注射組評(píng)分為1-3分。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,NC組評(píng)分一致(0分)。HE染色顯示NC組椎間盤(pán)高度無(wú)任何狹窄,而單純?cè)炷＝M則顯示嚴(yán)重退變程度,表現(xiàn)為AF斷裂及高度降低,其他治療組則顯示髓核中度退變,但椎間盤(pán)高度變化均有一定程度的延緩。PMs+MSCs注射組顯示較為滿意的高度維持。番紅O染色顯示MSCs注射組和PMs+MSCs注射組內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)GAG類似,在sham組和部分PMs注射組中顯示髓核退變比較嚴(yán)重。然而,PMs注射組與MSCs注射組對(duì)椎間盤(pán)功能的維持效果類似。番紅O染色顯示治療后12周PMs注射組和PMs+MSCs注射組可見(jiàn)疑似PM網(wǎng)絡(luò)支架,在24周時(shí),PM材料在所有切片中幾乎看不見(jiàn),而在這兩組中可見(jiàn)疑似海藻酸鈉材料。24周時(shí)可在MSCs注射組和PMs+MSCs注射組均可觀察到少許GFP陽(yáng)性MSCs。而在PMs+MSCs組內(nèi)似乎可見(jiàn)到更多陽(yáng)性表達(dá)。ELISA檢測(cè)了各組髓核中SOX9、PG、COL2和COL1蛋白表達(dá)結(jié)果,與正常組對(duì)比,其他組軟骨相關(guān)標(biāo)記物均顯著降低。然而,與sham組比較,PMs注射組和MSCs注射組的成軟骨相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增高。與MSCs注射組比較,PMs+MSCs注射組內(nèi)SOX9和COL1表達(dá)無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而PG和COL2表達(dá)均顯著增加(P0.05)。1月后在單純MSCs注射組椎間盤(pán)周圍組織中可以明顯觀察到纖維化組織,而PMs+MSCs注射組則較少陽(yáng)性表達(dá),在單純MSCs組椎間盤(pán)注射周圍組織中也可以觀察到GPF-MSCs陽(yáng)性染色表達(dá)。HE染色可以觀察到單純MSCs組椎間盤(pán)注射周圍組織較多纖維化組織,而在PMs+MSCs組則纖維化組織較其他組均明顯減少。COL2及PG染色顯示單純細(xì)胞注射組椎間盤(pán)注射周圍組織有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。3、無(wú)任何癥狀性青年人頸椎椎間盤(pán)的Pfirrmann分級(jí)主要為Ⅰ-Ⅱ級(jí),但Ⅲ級(jí)發(fā)病率仍較高(36%)。所有解剖節(jié)段的髓核T2值均比同節(jié)段的AF值高(P0.000),在同一節(jié)段,男女之間的髓核、前、后纖維環(huán)值均無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。髓核T2值與Pfirrmann值呈一致性降低。線性相關(guān)分析顯示Pfirrmann分級(jí)與髓核的T2值呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(P=0.000),但與纖維環(huán)的T2值無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.854),然而,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示非退行性改變的椎間盤(pán)(PfirrmannⅠ-Ⅱ級(jí))T2值極值分布較大。ROC曲線分析顯示Ⅰ級(jí)椎間盤(pán)的T2可信度界值為(62.03ms),Ⅱ級(jí)椎間盤(pán)的T2可信度界值為(54.60-62.03 ms),Ⅲ級(jí)椎間盤(pán)的T2可信度界值為(54.60 ms)。結(jié)論首先,體外器官培養(yǎng)模型顯示PMs能夠有效改善的細(xì)胞存留和存活狀態(tài)。PMs微冰膠輔助ADSCs移植犬退行性病變椎間盤(pán)髓核后能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)期存活,并且能夠增加髓核內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的含量及含水量,延緩椎間盤(pán)高度及亮度的降低,能夠有效延緩椎間盤(pán)退變的進(jìn)展。該研究結(jié)果證實(shí)了PMs微冰膠輔助間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)修復(fù)退變椎間盤(pán)的潛能,可注射PMs在細(xì)胞治療椎間盤(pán)退變的方法中可能是一種十分有效的策略。其次,T2弛豫值為鑒別青年人早期椎間盤(pán)退變提供一種更加敏感及更有力的檢測(cè)手段,并且為青年人頸椎間盤(pán)的早期診斷提供可信的量化區(qū)間。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R681.53;R445.2
【部分圖文】：

值與腦脊液的灰度值比作為相對(duì)灰度指數(shù)Ｓ護(hù)３１。腰椎正側(cè)位Ｘ線平片及ＭＲＩ的??測(cè)量均由Ｈ個(gè)觀察員盲法進(jìn)行測(cè)量，每幅圖像重復(fù)測(cè)量３次，取其平均值，作為??測(cè)量結(jié)果（若測(cè)量誤差較大，則數(shù)據(jù)舍去）（圖１－２）。??圖１－２椎間盤(pán)信號(hào)值的測(cè)量??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｉｇｎａｌ?ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ?０?ｆ?ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ?ｄｉｓｃ??１丄８．２．３免疫組化染色和免疫巧光染色??①

利用慢病毒轉(zhuǎn)染犬脂肪源ＭＳＣｓ，使細(xì)胞表達(dá)綠色巧光蠶白（如Ｐ）??用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，使細(xì)胞融合表達(dá)莖火蟲(chóng)英冠素酶（Ｌｕｃ）和ＧＦＰ用于體外器??官培養(yǎng)檢測(cè)（圖１－４Ａ）。單個(gè)犬運(yùn)動(dòng)節(jié)段的體外器官培養(yǎng)模型用于追蹤注射后的??細(xì)胞。通過(guò)生物光活體成像觀察注射到器官中的ＬＵＣ－ＧＦＰ＋陽(yáng)性細(xì)胞，可Ｗ觀察??到細(xì)胞存留及存活情況。ＭＳＣ轉(zhuǎn)染病毒后用流式細(xì)胞術(shù)篩選陽(yáng)性細(xì)胞，ＭＳＣｓ??可Ｗ高表達(dá)巧光素酶至少一個(gè)月Ｗ上。抽吸髓核后，利用２１Ｇ注射器針頭將懸??浮在０．５％的透明質(zhì)酸溶液中４０叫ＬＵＣ－ＧＦＰ＋?ＭＳＣｓ裝載的ＰＭｓ?（ＰＭｓ?＋?ＭＳＣｓ注??射組）混合液注射到椎間盤(pán)中，單純ＭＳＣｓ注射組作為對(duì)照組，如圖４Ｂ所示，??將每?jī)蓚�(gè)運(yùn)動(dòng)節(jié)段培養(yǎng)在一個(gè)玻璃瓶中１月余。向椎間盤(pán)注射后立即通過(guò)生物??發(fā)光活體成像儀觀察，均發(fā)現(xiàn)單純ＭＳＣｓ注射組明顯的細(xì)胞滲漏，而ＰＭｓ?＋?ＭＳＣｓ??注射組均無(wú)滲漏現(xiàn)象（圖１－４Ｃ）。持續(xù)培養(yǎng)１月期間

??光素底物溶液中，記錄與細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生的光子。如圖１－４Ｅ和Ｆ，分組與培養(yǎng)時(shí)??間的交互效應(yīng)對(duì)于ＰＭｓ＋ＭＳＣｓ均有盈著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｆ＝１７．２３１，Ｆ＝２４．４９２，??ＰＯ．ＯＯＯ）。而在５天、１０天、１５天的同一時(shí)間點(diǎn)，ＰＭｓ＋ＭＳＣｓ與ＭＳＣｓ組對(duì)比??均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＜０．０５），２０天和２５天兩組對(duì)比均無(wú)顯著性差異??（Ｐ＞０．０５），ＰＭｓ＋ＭＳＣｓ注射組能夠顯著存留細(xì)胞，細(xì)胞信號(hào)持續(xù)表達(dá)長(zhǎng)達(dá)２５??天。但單純ＭＳＣｓ注射組在１５天后即無(wú)法觀察到光子信號(hào)，１個(gè)單純ＭＳＣｓ注??射椎間盤(pán)組光子信號(hào)表達(dá)僅為１０天。??㈱壁芭’?ｉ：ｌｉＵｌｌ??Ｅ?ｃＭ?ｄ５?ｄ１０?ｄ１５?ｄ２０?ｄ巧?ＭＳＣｓ??只朽。ｎｎｆｉ．。］、?＊ｐｍｓ＋ｍｓｃｓ??Ｉ?起�。。停螅悖�??跑匪隱心??ＭＳＣｓ?ＰＭｓ?＋?ＭＳＣｓ??圖１－４?ＰＭｓ輔助的細(xì)胞注姑在體外椎間盤(pán)器官培養(yǎng)模型中展現(xiàn)了良好的防細(xì)胞滲漏及改善??細(xì)胞存留的巧能??（Ａ）利用慢病毒轉(zhuǎn)染法令犬脂肪來(lái)源ＭＳＣｓ表達(dá)ＧＦＰ?（上行）或Ｌｕｃ－ＧＦＰ?（下行），成像??系統(tǒng)為以１１１山１３１￥１５１１。（：８）體外器官培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖，８〇１１１１玻璃瓶，瓶口巧松。（０生??物冷光成像顯示了細(xì)胞的直接注巧會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重滲漏

本文編號(hào)：2844795